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      本產(chǎn)品iF647-Tyramide，為熒光染料iF647標(biāo)記的酪胺，用于酪胺信號放大技術(shù)（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術(shù)。TSA技術(shù)主要原理：在過氧化氫H2O2存在時，辣根過氧化物酶HRP可以催化酪胺為一種非常活躍的短壽命中間體，在短時間內(nèi)，中間體可以共價結(jié)合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復(fù)合物，大量富集成以酶為中心的類似“島”狀的聚集團，因使用熒光染料iF647標(biāo)記了酪胺，使得抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。此外，可以通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)多重?zé)晒馊旧?

儲存與運輸

      冰袋（wet ice）運輸；-20℃保存，有效期12個月。

操作步驟

以組織切片為例，以下實驗步驟中的實驗用水均為純水，涉及到的試劑均需用戶自備，或參考ABC相關(guān)產(chǎn)品：

      1. 組織切片脫蠟至水；

      2. 抗原修復(fù)：根據(jù)所使用的一抗及樣本類型，采用合適方式對組織切片進行抗原修復(fù)。1×PBS（推薦ABC4220或ABC0020）清洗3次，每次5 min；

      3. 用免疫組化筆對組織畫圈標(biāo)記；

      4. （可選）向組織滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑（推薦ABC1239 A液），室溫孵育30 min，水洗5 min；

      5. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：向切片上加入3% H2O2覆蓋組織，室溫避光孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色。1×PBS清洗3次，每次5 min；

      6. 封閉：切片水分稍微甩干后，滴加3%BSA或血清封閉30 min。如果一抗是山羊來源，用10%驢血清封閉，其他來源則用3%BSA封閉；

      7. 孵育一抗：用1×PBS或封閉液（推薦ABC2028）將一抗稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的封閉液，滴加稀釋好的一抗覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。1×PBS清洗3次，每次5 min；

      8. 孵育HRP標(biāo)記的二抗：用1×PBS或封閉液（推薦ABC2028）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；

      9. 配制含0.03‰ H2O2的Tyramide稀釋液：1×TBST（推薦ABC0022） 100 mL，加入100 μL 3%H2O2，混勻即可。因H2O2容易分解，本溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

      10. 配制TSA染色工作液：用上一步得到的Tyramide稀釋液，將iF555-Tyramide稀釋500倍，即每1 mL Tyramide稀釋液與2 μL iF555-Tyramide混勻，得到TSA染色工作液。每個樣品滴加100 μL染色工作液，室溫避光孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；

      （注：TSA染色工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，需4℃避光保存，24h內(nèi)有效）

      11. 微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液（根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液）的修復(fù)盒中進行微波加熱處理，去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。

      （注：如需進行雙重或多重?zé)晒馊旧瑒t按此步驟往下進行。如不需進行雙重或多重?zé)晒馊旧?，則跳過此步驟，接步驟12進行）

      12. 重復(fù)步驟7-11，孵育第二個一抗、二抗，以及TSA標(biāo)記，并微波處理去除一抗、二抗。

      13. 細(xì)胞核復(fù)染DAPI：切片稍甩干后在組織上滴加DAPI染色液（推薦ABC1030），避光室溫孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min。

      14. （可選）組織自發(fā)熒光淬滅：向組織上滴加自發(fā)熒光淬滅劑（推薦ABC1239 B液），室溫孵育5 min，流水沖洗3 min。

      15. 封片及鏡檢：切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片（推薦ABC1419）。選擇合適的熒光通道觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。

注意事項

      1. 本產(chǎn)品室溫融化后，使用離心機進行短暫離心，干凈吸頭吹吸混勻后取用。

      2. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的信號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎(chǔ)上再擴大5-10倍，以減少非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景熒光。建議設(shè)置一抗梯度濃度獲得最佳效果。

      3. 如背景熒光較強，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。

      4. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整稀釋比例（建議稀釋比例范圍1:200 - 1:1000）。

      5. 如進行多重?zé)晒鈽?biāo)記，建議先孵育多抗，后孵育單抗；先孵育低豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體，再孵育高豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體。

      6. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。