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      絕大多數(shù)正常細(xì)胞的分裂能力是有限的，在不能分裂后就進(jìn)入衰老狀態(tài)，此過程即為細(xì)胞衰老（cell senescence），細(xì)胞衰老是細(xì)胞控制其生長潛能的保障機制，一般含義是復(fù)制型衰老（replicative senescence）。正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后停止分裂，出現(xiàn)不可逆的生長停滯，此時細(xì)胞仍然是存活的，但是細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活性發(fā)生明顯變化，通常表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大，與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶為活化狀態(tài)。β-半乳糖苷酶是細(xì)胞溶酶體內(nèi)的水解酶，通常在pH 4.0時表現(xiàn)活性，但在衰老細(xì)胞內(nèi)該酶在pH 6.0條件下表現(xiàn)活性。本試劑盒即是基于此現(xiàn)象及原理，針對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性水平上調(diào)而對衰老組織或細(xì)胞進(jìn)行染色。具體反應(yīng)原理就是以X-Gal為底物，衰老細(xì)胞特異性β-半乳糖苷酶催化該底物生成藍(lán)色產(chǎn)物，表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)有藍(lán)色沉積物，可以在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。按照每個樣品染色液用量為1 mL計算，本試劑盒可完成100個樣品的染色。

儲存與運輸

      冰袋（wet ice）運輸；4℃避光保存，有效期12個月。其中X-Gal粉末如果配制成溶液后分裝成小份-20℃保存，3個月內(nèi)有效。

使用方法

      l 試劑準(zhǔn)備

      1. 自備PBS緩沖液（推薦ABC4220）。

      2. 將100 mg X-Gal粉末用5 mL DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解混勻，分裝至1.5 mL潔凈離心管中，每管0.5 mL，-20℃避光保存。避免反復(fù)凍融。

      3. 按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，每孔需要1.0-1.5 mL染色工作液，如果是12孔板，每孔需要0.5-1.0 mL染色工作液。根據(jù)樣本量配制染色液，避免浪費。

      l 染色步驟

      1. 對于貼壁細(xì)胞

      (1) 6孔板培養(yǎng)好的細(xì)胞（或細(xì)胞爬片），吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。

      (2) 棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次2 min。

      (3) 用移液器將PBS 吸除干凈，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液，置于37℃孵育2 h至過夜。注意：不能在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。染色期間需及時觀察顯色情況，如果樣本中β-半乳糖苷酶表達(dá)量較高，在數(shù)小時內(nèi)即可完成染色。如果β-半乳糖苷酶表達(dá)量低，則需適當(dāng)延長孵育時間，期間需用保鮮膜或parafilm封住6孔板，防止液體蒸發(fā)影響染色結(jié)果。

      (4) 普通光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞顯色后，去除染色工作液。如果需要復(fù)染細(xì)胞核，向孔板內(nèi)加入少量核固紅染液（推薦ABC1053）覆蓋細(xì)胞室溫染色3 min，去除染色液，用PBS清洗數(shù)次。

      (5) 加入2 mL PBS覆蓋細(xì)胞，至此染色完成，此樣本可于4℃保存1周?；蛘呒尤?0%甘油覆蓋細(xì)胞，4℃可保存較長時間。如果是細(xì)胞爬片，則可將爬片充分烤干，二甲苯透明后滴加中性樹膠封片，可長期保存。

      2. 對于冰凍切片

      (1) 冰凍切片室溫復(fù)溫10 min。以組化筆畫圈，將組織圈出。

      (2) 向組織上滴加適量β-半乳糖苷酶染色固定液，以完全覆蓋住組織為宜，室溫固定20 min。

      (3) 組織切片經(jīng)PBS浸泡洗滌3次，每次5 min。

      (4) 將切片置于避光濕盒中，向組織上滴加適量β-半乳糖苷酶染色工作液，需完全覆蓋住組織。濕盒放入37℃孵育，每隔2 h顯微鏡下觀察顯色情況，如果未見顯色，則繼續(xù)孵育，直到組織上衰老細(xì)胞顯色。如果樣本需過夜孵育，則需滴加足量的β-半乳糖苷酶染色工作液，防止染液蒸發(fā)干片。

      (5) 待組織顯色后，去除染色液，切片入PBS浸洗2次，純水浸洗2次。

      (6) （可選）滴加核固紅染液（推薦ABC1053）染色3 min，水洗3次。

      (7) 切片無水乙醇脫水2次，每次5 min再經(jīng)二甲苯透明5 min，滴加中性樹膠封片。

      3. 染色結(jié)果

      衰老細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈散在分布的藍(lán)色。

注意事項

      1. X-Gal溶液需室溫完全解凍混勻后再使用。

      2. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢復(fù)至室溫后再使用，配制好的染色工作液需充分混勻無沉淀方可使用。

      3. 衰老細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色反應(yīng)依賴于特定的pH條件，不能在CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育顯色，否則會影響染色工作液的pH，導(dǎo)致染色失敗。

      4. 配制染色工作液時請選擇聚丙烯（PP）或玻璃材質(zhì)的耗材，不能用聚苯乙烯（PS）材質(zhì)的耗材。

      5. 在顯色2 h-過夜期間需多次觀察顯色情況，時間過短可能導(dǎo)致陰性結(jié)果；時間太長則可能導(dǎo)致假陽性。顯色時間與樣本本身所含的β-半乳糖苷酶量多少有密切關(guān)系。

      6. 在配制染色工作液前，需檢查染色液A的pH值，如果不是6.0（可能因保存條件導(dǎo)致pH發(fā)生改變），需用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0再使用。

      7. 組織切片的β-半乳糖苷酶染色，對于樣本的前期準(zhǔn)備要求較高，樣本需-80℃保存，并盡快完成檢測。因為β-半乳糖苷酶非常容易失活，樣本保存不當(dāng)或時間過久，都可能導(dǎo)致酶失活，則染色時沒有陽性。

      8. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。

圖例：

      Fig.1 WI-38 細(xì)胞經(jīng)β-半乳糖苷酶試劑盒染色，左圖為無分裂增殖能力但仍然存活的衰老(senescence)WI-38細(xì)胞，經(jīng)染色后陽性著色細(xì)胞大于 95%。右圖是新復(fù)蘇的傳代次數(shù)小于3次的WI-38細(xì)胞(early passage)，經(jīng)染色后無明顯陽性細(xì)胞。