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需準備的材料設(shè)備

1. 能夠檢測450 nm吸光度的酶標儀，參考波長630 nm（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）；

2. 單道或多道移液器及吸頭，加樣槽，離心管；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 干性濾紙或吸水紙；

5. 渦旋混勻儀，微孔板振蕩器。

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樣本的采集與保存

1. 血清樣本：采集血樣，靜置30分鐘，血液凝固。取液體部分進行離心分離，1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

3. 細胞培養(yǎng)上清：300 g離心10分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

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注意：

1. 樣本如果渾濁，必須離心去除沉淀物，不適用嚴重溶血或高血脂的樣本。

2. 以上樣本均需密封保存，4℃保存不超過1周，-20℃保存不超過1個月，-80℃保存不超過2個月。

3. 冷凍樣本使用前應(yīng)緩慢平衡至室溫。

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試劑的配制

1. 提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出，平衡至室溫。按實驗需求取出本次實驗所需板條和試劑，每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。

2. 1×洗液配制：取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸餾水或去離子水至750 mL，輕輕混勻。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。

3. 標準品配制：將稀釋液A按照標簽標注體積加入標準品中，輕柔渦旋振蕩，確保充分混勻。重溶后的標準品濃度為1000 pg/mL，即為濃縮的人INS標準品。重溶后靜置10分鐘，稀釋前充分混勻。

a) 血清/血漿樣本標準曲線制備：

充分混勻重溶后的標準品，取500 μL濃縮的人Insulin標準品，加入500 μL稀釋液A，作為標準曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL稀釋液A。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標準品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0為稀釋液A。

b) 細胞培養(yǎng)上清樣本標準曲線制備：

充分混勻重溶后的標準品，取500 μL濃縮的人Insulin標準品，加入500 μL細胞培養(yǎng)基，作為標準曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL細胞培養(yǎng)基。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標準品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0為細胞培養(yǎng)基。

 

4. 1×檢測抗體配制：檢測抗體短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×檢測抗體工作液，臨用前配制。

5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×SA-HRP工作液，臨用前配制。

注意：

1. 未開封的試劑盒：未拆封的試劑盒可整盒保存于４℃，有效期12個月。

2. 已開封的試劑盒：有效期4周，凍干標準品溶解后不能再次使用，剩余試劑及時放置4℃保存。此外，請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好，并拉緊密封鋁箔袋，置于4℃保存。

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操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標準孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標準品及樣本，設(shè)標準孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同濃度的標準品，空白孔每孔加入100 μL稀釋液A，余孔每孔加入待測樣品100 μL，封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育2小時；

注意：請先查閱相關(guān)文獻確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請進行適當稀釋或濃縮后再檢測。

2. 洗板：自動洗板機或手工洗板，每孔洗滌液為300 μL，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標板倒扣在吸水紙上適當用力拍干，棄去孔內(nèi)液體；

3. 加檢測抗體：用稀釋液B將檢測抗體稀釋至工作濃度，每孔加1×檢測抗體工作液100 μL（臨用前配制），更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育1小時；

4. 洗板：重復(fù)步驟2；

5. 加SA-HRP：用稀釋液B將SA-HRP稀釋至工作濃度，每孔加1×SA-HRP工作液（臨用前配制）100 μL，更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育30分鐘；

6. 洗板：重復(fù)步驟2；

7. 加顯色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更換新的封板膜，室溫避光顯色（反應(yīng)時間應(yīng)控制在10-30分鐘，不要超過30分鐘。當標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）；

8. 加終止液：每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻；

9. 讀數(shù)：在確保酶標板底部無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，10分鐘內(nèi)用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時讀值，僅使用450 nm讀值會降低準確度。

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注意事項

1. 試劑盒按說明書保存，使用前室溫平衡20-30分鐘。

2. 標準品為凍干粉，所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù)，請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

3. 25×洗液在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請37℃溫育使結(jié)晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB對人體有刺激性，操作時請注意適當防護，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

5. 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作時請注意適當防護，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

6. 如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍色，請立即停止使用。

7. 不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試，不能混用。

8. 本試劑盒的操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。

9. 檢測標準品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。

10. 在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強光照射。

11. 加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。

12. 在操作試劑盒或處理樣本時請穿實驗服，佩戴乳膠或一次性手套。

13. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

14. 為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染，加樣時請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭。

15. 洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。

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結(jié)果分析

1. 結(jié)果計算

為了獲得更準確的實驗結(jié)果，建議標準品及樣本進行復(fù)孔檢測。計算標準品和樣本的平均OD值，然后減去空白孔的OD值。

以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線，相關(guān)系數(shù)R值越接近1，擬合效果越好?；貧w分析確定最佳擬合曲線。

代入樣本檢測OD值，計算出樣本濃度，若樣本進行了稀釋，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度。

通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合，可以對標準曲線進行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準確度會降低。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測每塊酶標板都必須設(shè)立單獨的標準曲線。由于實驗操作條件的不同（如操作者、洗板條件和溫度條件等），每次實驗標準曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標準曲線僅供參考。

pg/mL	OD		Average	Corrected
500	3.106	3.297	3.202	3.159
250	2.067	2.179	2.123	2.080
125	1.208	1.271	1.240	1.197
62.5	0.759	0.823	0.791	0.748
31.25	0.429	0.463	0.446	0.403
15.63	0.262	0.296	0.279	0.236
7.82	0.138	0.179	0.159	0.116
0	0.034	0.052	0.043

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檢測步驟概要

1. 實驗前按說明書準備標準品、試劑及樣本；

2. 加樣（標準品或樣本）100 μL/孔，室溫振蕩2小時；

3. 洗滌5次后拍干，加檢測抗體工作液100 μL/孔，室溫振蕩1小時；

4. 洗滌5次后拍干，加SA-HRP工作液100 μL/孔，室溫振蕩30分鐘；

5. 洗滌5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室溫避光孵育10－30分鐘；

6. 加終止液50 μL/孔；

7. 10分鐘內(nèi)于450 nm波長處檢測OD值，參考波長630 nm。