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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End Products，RAGE)是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族的成員，是一種具有多種配體的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，包括可以啟動和延續(xù)免疫反應(yīng)的警報蛋白?？梢越閷?dǎo)晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）相互作用，與多種慢性炎癥有關(guān)。RAGE在正常生理條件下以低水平表達(dá)，但在慢性炎癥下由于各種RAGE配體的積累而高度上調(diào)。RAGE與阿爾茨海默病、糖尿病血管并發(fā)癥、心血管疾病和癌癥進(jìn)展相關(guān)。Mouse RAGE ELISA Kit通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，體外定量檢測小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)液體中的RAGE，可同時檢測天然的和重組的小鼠RAGE。

儲存與運輸

冰袋運輸；4℃保存，有效期12個月；開封后需在4周內(nèi)用完。

需準(zhǔn)備的材料設(shè)備

1. 能夠檢測450 nm吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長630 nm（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）；

2. 單道或多道移液器及吸頭，加樣槽，離心管；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 干性濾紙或吸水紙；

5. 渦旋混勻儀，微孔板振蕩器。

樣本的采集與保存

1. 血清樣本：采集血樣，靜置30分鐘，血液凝固。取液體部分進(jìn)行離心分離，1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：300 g離心10分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

注意：

1. 樣本如果渾濁，必須離心去除沉淀物，不適用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。

2. 以上樣本均需密封保存，4℃保存不超過1周，-20℃保存不超過1個月，-80℃保存不超過2個月。

3. 冷凍樣本使用前應(yīng)緩慢平衡至室溫。

試劑的配制

1. 提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出，平衡至室溫。按實驗需求取出本次實驗所需板條和試劑，每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。

2. 1×洗液配制：取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸餾水或去離子水至750 mL，輕輕混勻。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品配制：將稀釋液A按照標(biāo)簽標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品中，輕柔渦旋振蕩，確保充分混勻。重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4000pg/mL，即為濃縮的小鼠RAGE標(biāo)準(zhǔn)品。重溶后靜置10分鐘，稀釋前充分混勻。

a) 血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的小鼠RAGE標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL稀釋液A，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（2000pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL稀釋液A。吸取500 μL S7（2000pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為稀釋液A。

b) 細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的小鼠RAGE標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（2000pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。吸取500 μL S7（2000pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為細(xì)胞培養(yǎng)基。

4. 1×檢測抗體配制：檢測抗體短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×檢測抗體工作液，臨用前配制。

5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度。混勻制成1×SA-HRP工作液，臨用前配制。

注意：

1. 未開封的試劑盒：未拆封的試劑盒可整盒保存于４℃，有效期12個月。

2. 已開封的試劑盒：有效期4周，凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解后不能再次使用，剩余試劑及時放置4℃保存。此外，請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好，并拉緊密封鋁箔袋，置于4℃保存。

操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及樣本，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔每孔加入100 μL稀釋液A，余孔每孔加入待測樣品100 μL，封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育2小時；

注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請進(jìn)行適當(dāng)稀釋或濃縮后再檢測。

2. 洗板：自動洗板或手工洗板，每孔洗滌液為300 μL，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上適當(dāng)用力拍干，棄去孔內(nèi)液體；

3. 加檢測抗體：用稀釋液B將檢測抗體稀釋至工作濃度，每孔加1×檢測抗體工作液100 μL（臨用前配制），更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育1小時；

4. 洗板：重復(fù)步驟2；

5. 加SA-HRP：用稀釋液B將SA-HRP稀釋至工作濃度，每孔加1×SA-HRP工作液（臨用前配制）100 μL，更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育30分鐘；

6. 洗板：重復(fù)步驟2；

7. 加顯色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更換新的封板膜，室溫避光顯色（反應(yīng)時間應(yīng)控制在10-30分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）；

8. 加終止液：每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻；

9. 讀數(shù)：在確保酶標(biāo)板底部無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，10分鐘內(nèi)用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時讀值，僅使用450 nm讀值會降低準(zhǔn)確度。

注意事項

1. 試劑盒按說明書保存，使用前室溫平衡20-30分鐘。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù)，請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

3. 25×洗液在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請37℃溫育使結(jié)晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB對人體有刺激性，操作時請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

5. 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作時請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

6. 如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，請立即停止使用。

7. 不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試，不能混用。

8. 本試劑盒的操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。

9. 檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。

10. 在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強光照射。

11. 加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。

12. 在操作試劑盒或處理樣本時請穿實驗服，佩戴乳膠或一次性手套。

13. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

14. 為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染，加樣時請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭。

15. 洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。

結(jié)果分析

1. 結(jié)果計算

為了獲得更準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均OD值，然后減去空白孔的OD值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用計算機軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R值越接近1，擬合效果越好?；貧w分析確定最佳擬合曲線。

代入樣本檢測OD值，計算出樣本濃度，若樣本進(jìn)行了稀釋，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度。

通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會降低。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立單獨的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于實驗操作條件的不同（如操作者、洗板條件和溫度條件等），每次實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考。

檢測步驟概要

1. 實驗前按說明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本；

2. 加樣（標(biāo)準(zhǔn)品或樣本）100 μL/孔，室溫振蕩2小時；

3. 洗滌5次后拍干，加檢測抗體工作液100 μL/孔，室溫振蕩1小時；

4. 洗滌5次后拍干，加SA-HRP工作液100 μL/孔，室溫振蕩30分鐘；

5. 洗滌5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室溫避光孵育10－30分鐘；

6. 加終止液50 μL/孔；

7. 10分鐘內(nèi)于450 nm波長處檢測OD值，參考波長630 nm。