国产精品亚洲片在线va_日本香蕉视频ww_午夜大胆性人体_亚洲中文字幕网

      本試劑盒是利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動(dòng)子的線性化質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或合成的DNA為模板，以NTP為底物，在體外轉(zhuǎn)錄合成RNA。本試劑盒優(yōu)化了RNA體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，可以簡(jiǎn)單快速獲得大量的RNA分子，如果轉(zhuǎn)錄時(shí)在底物中加入修飾的核苷酸，可以制備生物素或染料標(biāo)記的RNA。本試劑盒制備的RNA可以用于體外翻譯、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)、雜交探針標(biāo)記、RNA剪切等生物實(shí)驗(yàn)。在反應(yīng)體系中1 μg的模板投入量可以產(chǎn)生大于100 μg的RNA，適用于制備各種長(zhǎng)度的RNA。

圖1 T7 RNA polymerase轉(zhuǎn)錄原理圖

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋（wet ice）運(yùn)輸；-20℃保存，12個(gè)月有效。

操作步驟

      1. 模板準(zhǔn)備：

            a. 以T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒為模板：為了得到特定長(zhǎng)度的RNA，質(zhì)粒模板必須完全線性化（需要純化后作為模板），且線性化的質(zhì)粒確保雙鏈為平末端或5’突出端（避免出現(xiàn)3’突出端），每個(gè)反應(yīng)建議模板量為1 μg；

            b. 以T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物或合成的DNA片段為模板：PCR擴(kuò)增模板時(shí)將T7啟動(dòng)子（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）加到非編碼鏈引物的5‘端。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為轉(zhuǎn)錄模板，但純化后會(huì)產(chǎn)出更多的RNA，每個(gè)反應(yīng)建議模板量為0.5 μg左右。

      2. 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照表格推薦反應(yīng)體系在潔凈的EP管中加入各種試劑，充分混勻后于37℃反應(yīng)2 h。（如合成小于300 nt的RNA，建議將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4 h或更長(zhǎng)時(shí)間）。

      1. 反應(yīng)完畢后向體系中加入1 μL DNase I，37℃反應(yīng)15 min，消化轉(zhuǎn)錄的DNA模板。

      2. 轉(zhuǎn)錄合成的RNA經(jīng)電泳分析、純化后，可用于下游實(shí)驗(yàn)。

      轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物定量、檢測(cè)：通過(guò)紫外吸收法可以測(cè)定RNA濃度（游離核苷酸會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性，RNA產(chǎn)物需要純化）；電泳檢測(cè)推薦采用1%甲醛瓊脂糖變性膠檢測(cè)，電泳液為1×MOPS Buffer（10×MOPS Buffer：0.4 M MOPS，pH 7.0，0.1 M Sodium Acetate，10 mM EDTA）。凝膠制備方法：稱取0.5 g瓊脂糖加入36 mL RNase-Free Water中，加熱溶化后，加入5 mL 10×MOPS Buffer。待溶液冷卻至不燙手時(shí)，加入9 mL甲醛溶液（37%），混勻后倒膠。電泳檢測(cè)時(shí)取適量RNA與RNA Loading Buffer混合，70℃孵育10 min后冰浴2 min，全部點(diǎn)樣。電泳結(jié)束后用EB或SerRed（ABC3624）染色觀察。

注意事項(xiàng)

      1. 人體皮膚表面含有豐富的RNase，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)帶好實(shí)驗(yàn)手套、口罩，實(shí)驗(yàn)耗材無(wú)菌無(wú)酶，防止RNase污染。

      2. 如需制備標(biāo)記RNA，請(qǐng)?zhí)鎿Q試劑盒中的NTP Mix。

      3. 試劑盒中對(duì)照模板轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度為500 nt。

      4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。