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  • JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 (ABC1533)
  • JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 (ABC1533)
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JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 (ABC1533)
價格:1238.0

產(chǎn)地:ABC

貨號:ABC1533

規(guī)格:100T

備注:可用于凋亡中期檢測

  • JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 (ABC1533)
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產(chǎn)品簡介

      JC-1是一種陽離子羰花青染料,能夠穿過細(xì)胞膜,在線粒體膜電位的作用下向線粒體聚集定位,是廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。當(dāng)線粒體膜電位較高時,JC-1在線粒體膜電位作用下聚集在線粒體的基質(zhì)中,其主要以聚合物(J-aggregates)的形式存在,呈現(xiàn)出紅色熒光(Ex=585 nm,Em=590 nm);當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不好,線粒體膜電位下降或者喪失,會導(dǎo)致JC-1大多以單體(Monomer)的形式存在于胞漿中,呈現(xiàn)出綠色熒光(Ex=514 nm,Em=529 nm)。因此,可以根據(jù)熒光顏色的紅綠轉(zhuǎn)化以及比例變化來判斷線粒體膜電位變化情況,而線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個重要標(biāo)志。

      JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit)是一種以JC-1熒光探針為主的試劑盒,本試劑盒對JC-1易析出等缺點進(jìn)行了改良,并在試劑盒中提供了相關(guān)試劑,可用于快速靈敏地檢測細(xì)胞或純化的線粒體膜電位變化,用于判斷早期的細(xì)胞凋亡,也是用來檢測細(xì)胞早期凋亡的常用方法。本試劑盒共可以檢測100個6孔板樣品;此外,本試劑盒中還提供CCCP(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)試劑,是一種線粒體中氧化磷酸化的質(zhì)子載體(氫離子載體)和解耦體,能夠促使線粒體對氫離子的通透性發(fā)生變化,導(dǎo)致線粒體膜電位下降或者喪失,可作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。

儲存與運輸

      冰袋(wet ice)運輸;-20℃保存;JC-1(500×)需避光保存,避免反復(fù)凍融;JC-1染色緩沖液(10×)和JC-1稀釋液可4℃保存;有效期12個月。

操作步驟

      1. JC-1染色工作液以及JC-1染色緩沖液配制:

            a. 取2 μLJC-1溶液(500×)與900 μL JC-1稀釋液充分混勻,然后再加入100 μL JC-1染色緩沖液(10×),旋渦震蕩混勻,配制成JC-1染色工作液備用(注意按順序配制此溶液);

            b. 取適量JC-1染色緩沖液(10×)用去離子水稀釋配制成1×JC-1染色緩沖液備用(后續(xù)步驟如無特殊說明,洗滌等步驟均使用1×JC-1染色緩沖液)。

      2. 陽性對照組設(shè)置:

            a. 取適量CCCP(100 mM)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋1000倍得到100 μM CCCP工作液;

            b. 用CCCP工作液孵育細(xì)胞30 min左右,隨后按照下方的JC-1染色步驟操作檢測線粒體膜電位。

      (注意:對于大部分細(xì)胞來說,上述處理方式處理過后,相比正常組,CCCP處理誘導(dǎo)后可以看到JC-1大多以單體的形式存在于胞漿中,呈現(xiàn)出較亮的綠色熒光,紅色熒光變?nèi)?;但是有些?xì)胞,CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定或優(yōu)化體系摸索最優(yōu)條件。)

      3. 懸浮細(xì)胞染色操作:

            a. 取1-6×105細(xì)胞,1000 g離心3-5 min去除原有培養(yǎng)基,加入JC-1染色緩沖液洗滌1次后,再離心去除JC-1染色緩沖液,用500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基重懸(可含血清和酚紅);

            b. 然后加入500 μLJC-1染色工作液,避光于CO2培養(yǎng)箱中孵育15-30 min(一般情況20 min即可,也可視情況調(diào)整孵化時間);

            c. 孵育結(jié)束后,依舊按常規(guī)懸浮細(xì)胞的處理方法,離心去除JC-1染色工作液后,用JC-1染色緩沖液洗滌2次;

            d. 適量JC-1染色緩沖液(1×)或細(xì)胞培養(yǎng)液(建議不含酚紅)重懸后,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,也可使用流式細(xì)胞儀等儀器分析。

      4. 貼壁細(xì)胞染色操作(6孔板為例):

      對于貼壁細(xì)胞,如需用流式細(xì)胞儀檢測,可先收集細(xì)胞,重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

            a. 去除原有含藥物或其他處理的細(xì)胞培養(yǎng)基后,加1 mL JC-1染色緩沖液,洗滌1-2次;

            b. 加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基(可含血清和酚紅);

            c. 加入1 mL JC-1染色工作液,輕晃混勻,避光于CO2培養(yǎng)箱中孵育15-30 min;

            d. 孵育結(jié)束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液,洗滌2次;

            e. 加入2 mL JC-1染色緩沖液(1×)或細(xì)胞培養(yǎng)液(建議不含酚紅);

            f. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察或用流式細(xì)胞儀等儀器分析。

      5. 對于提取純化的線粒體

            a. 900 μL JC-1染色工作液中加入100 μL總蛋白量為10-100 μg純化線粒體;

            b. 混勻后使用熒光分光光度計(激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為590 nm)或酶標(biāo)儀(當(dāng)激發(fā)波長不能設(shè)置為485 nm時,可以在475~520 nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長)等儀器進(jìn)行掃描檢測,也可通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,可參考步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行檢測。

      6. 熒光檢測與分析

            a. 檢測JC-1單體的波長參數(shù)為Ex=490 nm, Em=525 nm;JC-1聚合物的波長參數(shù)為Ex=525 nm, Em=590 nm;注意此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長,參數(shù)設(shè)置可以依情況在這參數(shù)左右進(jìn)行一個調(diào)整;

            b. 熒光顯微鏡拍照時,建議以正常組為標(biāo)準(zhǔn),確定紅色和綠色熒光的曝光時間,以正常組紅色熒光效果清晰,綠色熒光效果較暗為佳,并分別以正常組的紅色與綠色熒光的曝光時間去拍攝處理組熒光;

            c. 對結(jié)果的判斷:細(xì)胞狀態(tài)正常,主要呈現(xiàn)紅色熒光,表明其線粒體膜電位正常;如果出現(xiàn)綠色熒光大幅度增強(qiáng),說明線粒體膜電位出現(xiàn)下降,其可能處于細(xì)胞凋亡早期階段。

注意事項

      1. 為了使JC-1充分溶解,請按照操作順序進(jìn)行JC-1工作液配制。

      2. JC-1孵育過后的樣品,建議30 min內(nèi)檢測完畢。

      3. JC-1溶液、JC-1染色緩沖液(10×)如有沉淀生產(chǎn),可以適當(dāng)溫浴溶解。

      4. JC-1最終檢測時,建議使用不含酚紅的細(xì)胞培養(yǎng)液,避免造成背景色干擾,JC-1染色孵育階段酚紅對結(jié)果無影響。

      5. 如每次使用的JC-1溶液較少,可能要涉及多次的反復(fù)凍融,請視情況分裝,盡量避免JC-1溶液多次反復(fù)凍融。

      6. 操作時請穿實驗服,佩戴一次性手套。

本產(chǎn)品僅供科研用途,不用于臨床診斷!

(產(chǎn)品包裝升級中,以實物為準(zhǔn)。)

下載說明書