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      DiO，又稱 DiOC₁₈(3)，中文全稱3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并惡唑-2-亞基)-1-丙烯-1-基]苯并惡唑高氯酸鹽，分子量881.72，是一類具有親脂性的長鏈二烷基碳菁類染料熒光染料，常用于標(biāo)記細(xì)胞膜以及其他脂溶性生物結(jié)構(gòu)。DiO進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴散，逐漸使整個細(xì)胞膜被染色。DiO在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，當(dāng)與細(xì)胞結(jié)合后熒光強度會大大增強，被激發(fā)后可以發(fā)出綠色熒光，并可以用標(biāo)準(zhǔn)的FITC濾光片檢測。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長501nm。根據(jù)DiO的特性，其可以用于活細(xì)胞以及固定細(xì)胞的染色。此外DiO探針一般不影響細(xì)胞的生存能力，故可正向或逆向的標(biāo)記細(xì)胞或某些物質(zhì)（外泌體）用作示蹤檢測。

      本產(chǎn)品DiO細(xì)胞膜綠色熒光染色試劑盒，包含DiO熒光探針及優(yōu)化的染色緩沖液，使細(xì)胞膜染色更加快速、熒光更加明亮穩(wěn)定、效果更好。

儲存與運輸

      干冰(wet ice)運輸；-20℃避光保存，探針避免反復(fù)凍融，有效期至少6個月。

操作步驟

      1. DiO染色工作液配制：

            1.1. 將DiO細(xì)胞膜綠色熒光探針與染色緩沖液以1:250比例混合稀釋，配制成DiO染色工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；注意，DiO探針稀釋比可根據(jù)具體情況在1:250-1:500進(jìn)行調(diào)整，以獲得最佳染色效果。

      2. 懸浮活細(xì)胞染色：

            2.1. 收集懸浮細(xì)胞，以500-1000 g室溫離心3-5 min，去除細(xì)胞上清；

            2.2. 使用DiO染色工作液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度在1-2×10⁶個/mL；

            2.3. 置于37℃避光孵育5-20 min；建議根據(jù)具體細(xì)胞調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

            2.4. 孵育結(jié)束后，500-1000 g室溫離心3-5 min，吸除DiO染色工作液；

            2.5. 用37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，500-1000 g離心3-5 min，去除上清；

            2.6. 重復(fù)2.5步驟一次；

            2.7. 流式細(xì)胞儀上機檢測，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿或者載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長501nm。

      3. 貼壁活細(xì)胞染色（6孔板為例）：

            3.1. 將細(xì)胞提前以一定密度種植于6孔板中；

            3.2. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS（ABC4220）洗滌細(xì)胞2次。加入1 mL DiO染色工作液（其他規(guī)格孔板，視情況調(diào)整，保證染料覆蓋細(xì)胞）；

            3.3. 置于37℃避光孵育5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細(xì)胞調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

            3.4. 用37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞1-2次；

            3.5. 加入37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長501nm。

      4. 固定的貼壁細(xì)胞或切片染色：

            4.1. 樣本前處理：

            對于細(xì)胞：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌1-2次。加入4%多聚甲醛固定液（ABC1119），室溫固定 10 min。吸除固定液，用PBS洗滌2-3次。

            4.2. 加入0.1-0.5% Triton-100（PBS配制）處理細(xì)胞或切片，室溫通透10 min；吸除通透液，用PBS洗滌2-3次；

            4.3. （可選，免疫熒光標(biāo)記）按照免疫熒光染色的方法進(jìn)行抗體的孵育或其他染料進(jìn)行染色。注意?？贵w孵育過程中的封閉液、抗體稀釋液、洗滌液等不能含有去垢劑。

            4.4. 加入適量體積的DiO染色工作液覆蓋細(xì)胞，37℃避光孵育5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細(xì)胞樣本調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

            4.5. 細(xì)胞或切片經(jīng)PBS洗滌2-3次，然后置于熒光顯微鏡觀察（細(xì)胞需以適量PBS覆蓋）。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長501nm。

      5. 外泌體熒光標(biāo)記：

            5.1. 將提取的外泌體沉淀，用適量DiO染色工作液重懸；

            5.2. 將樣品置于37℃避光孵育30 min；

            5.3. 用10倍體積PBS稀釋樣品體積（可選）；

            5.4. 按照之前提取獲得外泌體的方案，再一次提外泌體，以去除多余的染料；

            5.5. 收集的外泌體沉淀，用PBS重懸，得到DiO標(biāo)記的外泌體?？捎糜谙鄳?yīng)的后續(xù)實驗，例如細(xì)胞攝取。

注意事項

      1. 熒光染料均存在淬滅問題，請注意避光以減緩熒光猝滅。

      2. 探針親脂性的特點，實驗過程中請避免使用含有甘油或其它有機物的試劑，否則會影響染色效果。

      3. 當(dāng)需要固定操作時，樣品宜在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，其他不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景高。

      4. 由于細(xì)胞間敏感性和實驗?zāi)康牡牟煌结樀淖罴严♂尡群妥罴逊跤龝r間需根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整。

      5. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。