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本產(chǎn)品TSAPLus熒光三重染色試劑盒，適用于石蠟切片免疫熒光多重染色，尤其適用于相同來源一抗的多重?zé)晒饷庖邩?biāo)記，也可用于不同來源抗體的多重?zé)晒饷庖邩?biāo)記。主要原理是基于酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術(shù)。TSA技術(shù)主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)（即熒光標(biāo)記的酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價鍵結(jié)合位點），產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng)，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基（包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基）結(jié)合，在抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。本試劑盒使用熒光染料488/555/647對酪胺進行標(biāo)記，得到的熒光酪胺熒光強，信號穩(wěn)定，應(yīng)用于多次重復(fù)免疫標(biāo)記實現(xiàn)多重?zé)晒馊旧?

試劑盒內(nèi)各組分按各自所需條件保存，冰袋（wet ice）運輸。12個月有效。

1.自備0.01 mol/L PBS緩沖液（pH7.0-7.4，推薦ABC4220或ABC0020），3% H2O2和0.3% H2O2；

2.自備一抗及相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，抗原修復(fù)液（根據(jù)抗體及組織類型選擇合適的抗原修復(fù)液）；

3.根據(jù)用量，按照下表比例配制TSA染色工作液。

注：熒光Tyramide融化后離心機短時離心，干凈吸頭吹吸混勻后取用。TSA染色工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，需4℃避光保存，24h內(nèi)有效。

以組織切片為例，以下實驗步驟中的實驗用水均為純水：

1.組織切片脫蠟至水；

2.抗原修復(fù)：根據(jù)所使用的一抗及樣本類型，采用合適方式對組織切片進行抗原修復(fù)。PBS清洗3次，每次5min；

3.用免疫組化筆對組織畫圈標(biāo)記；

4.滅活內(nèi)源性過氧化物酶：向切片上滴加3%H2O2覆蓋組織，室溫避光孵育25min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色。PBS清洗3次，每次5min；

5.封閉：切片水分稍微甩干后，向組織上滴加3%BSA或血清封閉30 min，具體根據(jù)一抗及二抗種屬決定封閉試劑；

6.一抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將一抗稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體，滴加稀釋好的一抗覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5min；

7.對應(yīng)HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

8.向組織上滴加50-100μL TSA-488染色工作液確保完全覆蓋組織，室溫避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

9.微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液（根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液）的修復(fù)盒中進行微波加熱處理，去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。（微波建議的溫度和時間; 加熱到95攝氏度，維持15分鐘）此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。

10.重復(fù)步驟6，進行第二個一抗的孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將需檢測的第二個抗體（一抗）稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體，滴加稀釋好的抗體覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5min；

11.重復(fù)步驟7，進行對應(yīng)HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

12.向組織上滴加50-100μL TSA-555染色工作液確保完全覆蓋組織，室溫避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

13.微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液（根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液）的修復(fù)盒中進行微波加熱處理，去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。（微波建議的溫度和時間; 加熱到95攝氏度，維持15分鐘）此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。

14.重復(fù)步驟6，進行第三個一抗的孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將需檢測的第三個抗體（一抗）稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體，滴加稀釋好的抗體覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5min；

15.重復(fù)步驟7，進行對應(yīng)HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗體稀釋液）將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

16.向組織上滴加50-100μL TSA-647染色工作液確保完全覆蓋組織，室溫避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

17.細胞核復(fù)染DAPI：切片稍甩干后在組織上滴加DAPI（即用型）染色液，避光室溫孵育10 min。PBS清洗3次，每次5min；

18.組織自發(fā)熒光淬滅（可選）：向組織上滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑（蘇丹黑），室溫孵育5min，流水沖洗3min；

19.封片及鏡檢：切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。

1. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的信號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎(chǔ)上再擴大5-10倍，以減少非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景熒光。建議設(shè)置一抗梯度濃度獲得最佳效果。

2. 如背景熒光較強，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。

3. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整稀釋比例（調(diào)整范圍1:200 - 1:1000）。

4. 如進行多重?zé)晒鈽?biāo)記，建議先孵育多抗，后孵育單抗；先孵育低豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體，再孵育高豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體。