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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

降鈣素原（Procalcitonin，PCT）是降鈣素（CT）超家族的成員，由116個(gè)氨基酸組成的分子量約為14.5 kDa的多肽。分為三個(gè)部分：氨基末端，未成熟降鈣素和降鈣素羧基末端肽。降鈣素原屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族，由位于11號染色體上的CALC-1基因編碼產(chǎn)生，在受到細(xì)菌感染時(shí)，脂多糖（LPS）、微生物毒素和炎癥介質(zhì)（如IL-6或TNF-α）均能刺激PCT的產(chǎn)生。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大小和類型、細(xì)菌的種類、炎癥的程度和免疫反應(yīng)的狀況，是診斷和監(jiān)測細(xì)菌炎性疾病感染的一個(gè)參數(shù)，反映了全身炎癥反應(yīng)的活躍程度。PCT是嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥和真菌感染的特異性指標(biāo)，而且也是膿毒癥和炎癥活動有關(guān)的多臟器衰竭的可靠指標(biāo)。Human PCT ELISA Kit通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，體外定量檢測人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)液體中的PCT，可同時(shí)檢測天然的和重組的人PCT。

儲存與運(yùn)輸

冰袋運(yùn)輸；4℃保存，有效期12個(gè)月；開封后需在4周內(nèi)用完。

需準(zhǔn)備的材料設(shè)備

1. 能夠檢測450 nm吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長630 nm（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）；

2. 單道或多道移液器及吸頭，加樣槽，離心管；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 干性濾紙或吸水紙；

5. 渦旋混勻儀，微孔板振蕩器。

樣本的采集與保存

1. 血清樣本：采集血樣，靜置30分鐘，血液凝固。取液體部分進(jìn)行離心分離，1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：組織塊用預(yù)冷PBS洗滌，去除血污，稱重后剪成細(xì)小碎塊置于勻漿器中。加入10倍組織重量的PBS勻漿，得到的勻漿液經(jīng)過超聲處理至澄清。將制備好的勻漿液12000 g離心5分鐘，棄沉淀，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

4. 細(xì)胞裂解液

a) 對于貼壁細(xì)胞樣品：先用PBS清洗細(xì)胞2-3次，最后一次徹底吸干殘留液體。按照6孔板每孔細(xì)胞250 μL裂解液的比例吸取細(xì)胞裂解液于細(xì)胞培養(yǎng)板、瓶內(nèi)，反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使裂解液與細(xì)胞充分接觸3-5分鐘。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集到離心管中。12000 g離心5分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

b) 對于懸浮細(xì)胞樣品：離心收集細(xì)胞，按照6孔板每孔細(xì)胞250 μL裂解液的比例將細(xì)胞液與細(xì)胞裂解液混合，振蕩。冰浴30分鐘，期間每10分鐘用移液器反復(fù)吹打數(shù)次，確保細(xì)胞完全裂解。12000 g離心5分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：300 g離心10分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

注意：

1. 樣本如果渾濁，必須離心去除沉淀物，不適用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。

2. 以上樣本均需密封保存，4℃保存不超過1周，-20℃保存不超過1個(gè)月，-80℃保存不超過2個(gè)月。

3. 冷凍樣本使用前應(yīng)緩慢平衡至室溫。

試劑的配制

1. 提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出，平衡至室溫。按實(shí)驗(yàn)需求取出本次實(shí)驗(yàn)所需板條和試劑，每次檢測后剩余試劑請及時(shí)置于4℃保存。

2. 1×洗液配制：取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸餾水或去離子水至750 mL，輕輕混勻。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品配制：將稀釋液A按照標(biāo)簽標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品中，輕柔渦旋振蕩，確保充分混勻。重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000 pg/mL，即為濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品。重溶后靜置10分鐘，稀釋前充分混勻。

a) 血清/血漿/組織勻漿/細(xì)胞裂解液樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL稀釋液A，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個(gè)1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL稀釋液A。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個(gè)離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個(gè)離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為稀釋液A。

b) 細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個(gè)1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個(gè)離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個(gè)離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為細(xì)胞培養(yǎng)基。

4. 1×檢測抗體配制：檢測抗體短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×檢測抗體工作液，臨用前配制。

5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×SA-HRP工作液，臨用前配制。

注意：

1. 未開封的試劑盒：未拆封的試劑盒可整盒保存于4℃，有效期12個(gè)月。

2. 已開封的試劑盒：有效期4周，凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解后不能再次使用，剩余試劑及時(shí)放置4℃保存。此外，請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好，并拉緊密封鋁箔袋，置于4℃保存。

操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及樣本，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔每孔加入100 μL稀釋液A，余孔每孔加入待測樣品100 μL，封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育2小時(shí)；

注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請進(jìn)行適當(dāng)稀釋或濃縮后再檢測。

2. 洗板：自動洗板或手工洗板，每孔洗滌液為300 μL，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上適當(dāng)用力拍干，棄去孔內(nèi)液體；

3. 加檢測抗體：用稀釋液B將檢測抗體稀釋至工作濃度，每孔加1×檢測抗體工作液100 μL（臨用前配制），更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育1小時(shí)；

4. 洗板：重復(fù)步驟2；

5. 加SA-HRP：用稀釋液B將SA-HRP稀釋至工作濃度，每孔加1×SA-HRP工作液（臨用前配制）100 μL，更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育30分鐘；

6. 洗板：重復(fù)步驟2；

7. 加顯色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更換新的封板膜，室溫避光顯色（反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在10-30分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）；

8. 加終止液：每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻；

9. 讀數(shù)：在確保酶標(biāo)板底部無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，10分鐘內(nèi)用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時(shí)讀值，僅使用450 nm讀值會降低準(zhǔn)確度。

注意事項(xiàng)

1. 試劑盒按說明書保存，使用前室溫平衡20-30分鐘。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù)，請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

3. 25×洗液在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請37℃溫育使結(jié)晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB對人體有刺激性，操作時(shí)請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

5. 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作時(shí)請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

6. 如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，請立即停止使用。

7. 不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試，不能混用。

8. 本試劑盒的操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。

9. 檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。

10. 在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強(qiáng)光照射。

11. 加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。

12. 在操作試劑盒或處理樣本時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴乳膠或一次性手套。

13. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

14. 為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染，加樣時(shí)請注意每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭。

15. 洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。

結(jié)果分析

1. 結(jié)果計(jì)算

為了獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均OD值，然后減去空白孔的OD值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R值越接近1，擬合效果越好?；貧w分析確定最佳擬合曲線。

代入樣本檢測OD值，計(jì)算出樣本濃度，若樣本進(jìn)行了稀釋，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實(shí)際濃度。

通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會降低。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、洗板條件和溫度條件等），每次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考。

3. 靈敏度

人PCT的最低可檢測濃度為1.02 pg/mL(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。

此值為20個(gè)空白孔測定的平均OD值加上兩倍SD所對應(yīng)的濃度值。

4. 精密度

精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。變異系數(shù)CV（%）=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100；

批內(nèi)差：3個(gè)已知濃度的高、中、低樣本在同一批次酶標(biāo)板內(nèi)重復(fù)測定20次，評估酶標(biāo)板內(nèi)的精密度。批內(nèi)差：CV<4%。

批間差：3個(gè)已知濃度的高、中、低樣本在3個(gè)不同批次的試劑盒間重復(fù)測定8次，評估酶標(biāo)板間的精密度。批間差：CV<7%。

5. 回收率

于5份定值人血清中加入一定量的人PCT（加標(biāo)樣品），重復(fù)測定并計(jì)算其均值，未加人PCT的血清作為本底，計(jì)算回收率（回收率為測定值與理論值的比率）?；厥章实姆秶鷱?2%至105%，平均回收率96%。

6. 稀釋線性

于5份定值人血清中加入一定量的人PCT（加標(biāo)樣品），并在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行系列稀釋，評估檢測的線性。線性范圍即為稀釋后樣本中人PCT含量的測定值與理論值的比率。