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400-830-9659

Human Procalcitonin(PCT) ELISA Kit (ABC0030-96T)

價格：7143.0

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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
Human Procalcitonin(PCT) ELISA Kit	ABC0030-48T	48T
ABC0030-96T	96T

產(chǎn)品簡介

降鈣素原（Procalcitonin，PCT）是降鈣素（CT）超家族的成員，由116個氨基酸組成的分子量約為14.5 kDa的多肽。分為三個部分：氨基末端，未成熟降鈣素和降鈣素羧基末端肽。降鈣素原屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族，由位于11號染色體上的CALC-1基因編碼產(chǎn)生，在受到細(xì)菌感染時，脂多糖（LPS）、微生物毒素和炎癥介質(zhì)（如IL-6或TNF-α）均能刺激PCT的產(chǎn)生。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大小和類型、細(xì)菌的種類、炎癥的程度和免疫反應(yīng)的狀況，是診斷和監(jiān)測細(xì)菌炎性疾病感染的一個參數(shù)，反映了全身炎癥反應(yīng)的活躍程度。PCT是嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥和真菌感染的特異性指標(biāo)，而且也是膿毒癥和炎癥活動有關(guān)的多臟器衰竭的可靠指標(biāo)。Human PCTELISA Kit通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，體外定量檢測人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)液體中的PCT，可同時檢測天然的和重組的人PCT。

儲存與運(yùn)輸

冰袋運(yùn)輸；4℃保存，有效期12個月；開封后需在4周內(nèi)用完。

需準(zhǔn)備的材料設(shè)備

1.能夠檢測450 nm吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長630 nm（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）；

2.單道或多道移液器及吸頭，加樣槽，離心管；

3.蒸餾水或去離子水；

4.干性濾紙或吸水紙；

5.渦旋混勻儀，微孔板振蕩器。

樣本的采集與保存

1.血清樣本：采集血樣，靜置30分鐘，血液凝固。取液體部分進(jìn)行離心分離，1000g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

2.血漿：用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

3.組織勻漿：組織塊用預(yù)冷PBS洗滌，去除血污，稱重后剪成細(xì)小碎塊置于勻漿器中。加入10倍組織重量的PBS勻漿，得到的勻漿液經(jīng)過超聲處理至澄清。將制備好的勻漿液12000g離心5分鐘，棄沉淀，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

4.細(xì)胞裂解液

a)對于貼壁細(xì)胞樣品：先用PBS清洗細(xì)胞2-3次，最后一次徹底吸干殘留液體。按照6孔板每孔細(xì)胞250μL裂解液的比例吸取細(xì)胞裂解液于細(xì)胞培養(yǎng)板、瓶內(nèi)，反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使裂解液與細(xì)胞充分接觸3-5分鐘。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集到離心管中。12000 g離心5分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

b)對于懸浮細(xì)胞樣品：離心收集細(xì)胞，按照6孔板每孔細(xì)胞250μL裂解液的比例將細(xì)胞液與細(xì)胞裂解液混合，振蕩。冰浴30分鐘，期間每10分鐘用移液器反復(fù)吹打數(shù)次，確保細(xì)胞完全裂解。12000 g離心5分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

5.細(xì)胞培養(yǎng)上清：300g離心10分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

注意：

1.樣本如果渾濁，必須離心去除沉淀物，不適用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。

2.以上樣本均需密封保存，4℃保存不超過1周，-20℃保存不超過1個月，-80℃保存不超過2個月。

3.冷凍樣本使用前應(yīng)緩慢平衡至室溫。

試劑的配制

1.提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出，平衡至室溫。按實(shí)驗需求取出本次實(shí)驗所需板條和試劑，每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。

2.1×洗液配制：取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸餾水或去離子水至750 mL，輕輕混勻。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。

3.標(biāo)準(zhǔn)品配制：將稀釋液A按照標(biāo)簽標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品中，輕柔渦旋振蕩，確保充分混勻。重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000 pg/mL，即為濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品。重溶后靜置10分鐘，稀釋前充分混勻。

a)血清/血漿/組織勻漿/細(xì)胞裂解液樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL稀釋液A，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL稀釋液A。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為稀釋液A。

b)細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

充分混勻重溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，取500 μL濃縮的人PCT標(biāo)準(zhǔn)品，加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度S7（500 pg/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。吸取500 μL S7（500 pg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為細(xì)胞培養(yǎng)基。

4.1×檢測抗體配制：檢測抗體短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度。混勻制成1×檢測抗體工作液，臨用前配制。

5.1×SA-HRP配制：SA-HRP短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?；靹蛑瞥?×SA-HRP工作液，臨用前配制。

注意：

1.未開封的試劑盒：未拆封的試劑盒可整盒保存于4℃，有效期12個月。

2.已開封的試劑盒：有效期4周，凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解后不能再次使用，剩余試劑及時放置4℃保存。此外，請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好，并拉緊密封鋁箔袋，置于4℃保存。

操作步驟

1.加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及樣本，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔每孔加入100 μL稀釋液A，余孔每孔加入待測樣品100 μL，封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育2小時；

注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請進(jìn)行適當(dāng)稀釋或濃縮后再檢測。

2.洗板：自動洗板或手工洗板，每孔洗滌液為300 μL，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上適當(dāng)用力拍干，棄去孔內(nèi)液體；

3.加檢測抗體：用稀釋液B將檢測抗體稀釋至工作濃度，每孔加1×檢測抗體工作液100 μL（臨用前配制），更換新的封板膜封板，100-300rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育1小時；

4.洗板：重復(fù)步驟2；

5.加SA-HRP：用稀釋液B將SA-HRP稀釋至工作濃度，每孔加1×SA-HRP工作液（臨用前配制）100 μL，更換新的封板膜封板，100-300rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育30分鐘；

6.洗板：重復(fù)步驟2；

7.加顯色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更換新的封板膜，室溫避光顯色（反應(yīng)時間應(yīng)控制在10-30分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）；

8.加終止液：每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻；

9.讀數(shù)：在確保酶標(biāo)板底部無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，10分鐘內(nèi)用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時讀值，僅使用450 nm讀值會降低準(zhǔn)確度。

注意事項

1.試劑盒按說明書保存，使用前室溫平衡20-30分鐘。

2.標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù)，請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

3.25×洗液在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請37℃溫育使結(jié)晶完全溶解后再配制成工作液。

4.TMB對人體有刺激性，操作時請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

5.試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作時請注意適當(dāng)防護(hù)，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

6.如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，請立即停止使用。

7.不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試，不能混用。

8.本試劑盒的操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。

9.檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。

10.在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強(qiáng)光照射。

11.加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。

12.在操作試劑盒或處理樣本時請穿實(shí)驗服，佩戴乳膠或一次性手套。

13.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

14.為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染，加樣時請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭。

15.洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。

結(jié)果分析

1.結(jié)果計算

為了獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗結(jié)果，建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均OD值，然后減去空白孔的OD值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用計算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R值越接近1，擬合效果越好?；貧w分析確定最佳擬合曲線。

代入樣本檢測OD值，計算出樣本濃度，若樣本進(jìn)行了稀釋，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實(shí)際濃度。

通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會降低。

2.典型數(shù)據(jù)

每次檢測每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于實(shí)驗操作條件的不同（如操作者、洗板條件和溫度條件等），每次實(shí)驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考。

pg/mL	OD	Average	Corrected
500	2.783	2.676	2.730	2.712
250	1.534	1.526	1.530	1.512
125	0.852	0.884	0.868	0.850
62.5	0.433	0.458	0.446	0.428
31.25	0.242	0.294	0.268	0.250
15.63	0.141	0.152	0.147	0.129
7.81	0.078	0.086	0.082	0.064
0	0.018	0.018	0.018