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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

睪酮（Testosterone）是一種類固醇激素。雄性睪酮主要由睪丸間質細胞分泌，雌性睪酮由卵巢腎上腺和外周脂肪細胞產(chǎn)生，在血液中睪酮可以與血清蛋白非特異性結合。睪酮具有維持雄性肌肉強度及質量，維持骨質密度及強度，提升機體體能等作用，并且睪酮還會影響血液生成，體內(nèi)鈣平衡，骨礦化作用，脂代謝，糖代謝和前列腺的增長。Human Testosterone ELISA Kit通過競爭法酶聯(lián)免疫吸附技術，體外定量檢測人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關液體中的睪酮，可同時檢測天然的和合成的人睪酮。

儲存與運輸

冰袋運輸；4℃保存，有效期6個月；開封后需在4周內(nèi)用完。

需準備的材料設備

1. 能夠檢測450 nm吸光度的酶標儀，參考波長630 nm（建議參考儀器使用說明提前預熱）；

2. 單道或多道移液器及吸頭，加樣槽，離心管；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 干性濾紙或吸水紙；

5. 渦旋混勻儀，微孔板振蕩器。

樣本的采集與保存

1. 血清樣本：采集血樣，靜置30分鐘，血液凝固。取液體部分進行離心分離，1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復凍融。

2. 血漿：用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000 g離心15分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復凍融。

3. 細胞培養(yǎng)上清：300 g離心10分鐘，吸取上清即可檢測，或者分裝，分裝上清置于-20℃以下保存，避免反復凍融。

注意：

1. 樣本如果渾濁，必須離心去除沉淀物，不適用嚴重溶血或高血脂的樣本。

2. 以上樣本均需密封保存，4℃保存不超過1周，-20℃保存不超過1個，-80℃保存不超過2個月。

3. 冷凍樣本使用前應緩慢平衡至室溫。

試劑的配制

1. 提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出，平衡至室溫。按實驗需求取出本次實驗所需板條和試劑，每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。

2. 1×洗液配制：取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸餾水或去離子水至750 mL，輕輕混勻。轉移至干凈瓶內(nèi)。

3. 標準品配制：將稀釋液A按照標簽標注體積加入標準品中，輕柔渦旋振蕩，確保充分混勻。重溶后的標準品濃度為100 ng/mL，即為濃縮的人Testosterone標準品。重溶后靜置10分鐘，稀釋前充分混勻。

a) 血清/血漿樣本標準曲線制備：

充分混勻重溶后的標準品，取500 μL濃縮的人Testosterone標準品，加入500 μL稀釋液A，作為標準曲線的最高濃度S7（50 ng/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入400 μL稀釋液A。吸取200 μL S7（50 ng/mL）標準品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取200 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的3倍比稀釋。S0為稀釋液A。

b) 細胞培養(yǎng)上清樣本標準曲線制備：

充分混勻重溶后的標準品，取500 μL濃縮的人Testosterone標準品，加入500 μL細胞培養(yǎng)基，作為標準曲線的最高濃度S7（50 ng/mL）。取6個1.5 mL離心管（S1-S6）依次排列，各加入400 μL細胞培養(yǎng)基。吸取200 μL S7（50 ng/mL）標準品到第一個離心管S6中，輕輕吹打混勻。從S6中吸取200 μL到第二個離心管S5中，輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的3倍比稀釋。S0為細胞培養(yǎng)基。

4. 1×抗體配制：抗體短暫離心，用稀釋液A按照1:100倍稀釋至工作濃度。混勻制成1×抗體工作液，臨用前配制。

5. 1×酶標抗體配制：酶標抗體短暫離心，用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度。混勻制成1×酶標抗體工作液，臨用前配制。

注意：

1. 未開封的試劑盒：未拆封的試劑盒可整盒保存于4℃，有效期6個月。

2. 已開封的試劑盒：有效期4周，凍干標準品溶解后不能再次使用，剩余試劑及時放置4℃保存。此外，請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好，并拉緊密封鋁箔袋，置于4℃保存。

操作步驟

1. 加樣：分別設標準孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標準品及樣本，設標準孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同濃度的標準品，空白孔每孔加入100 μL稀釋液A，余孔每孔加入待測樣品100 μL；

2. 加抗體：用稀釋液A將抗體稀釋至工作濃度，每孔加抗體50 μL。封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育1小時；

注意：1.步驟1和2盡快完成，前后間隔不超過10min,步驟順序不能調(diào)換。

2.請先查閱相關文獻確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請進行適當稀釋或濃縮后再檢測。

3. 洗板：自動洗板或手工洗板，每孔洗滌液為300 μL，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標板倒扣在吸水紙上適當用力拍干，棄去孔內(nèi)液體；

4. 加酶標抗體：用稀釋液B將酶標抗體稀釋至工作濃度，每孔加酶標抗體工作液（臨用前配制）100 μL，更換新的封板膜封板，100-300 rpm振蕩（保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可），室溫振蕩孵育30分鐘；

5. 洗板：重復步驟3；

6. 加顯色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更換新的封板膜，室溫避光顯色（反應時間應控制在10-30分鐘，不要超過30分鐘。當標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）；

7. 加終止液：每孔加終止溶液50 μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻；

8. 讀數(shù)：在確保酶標板底部無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，10分鐘內(nèi)用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時讀值，僅使用450 nm讀值會降低準確度。

注意事項

1. 試劑盒按說明書保存，使用前室溫平衡20-30分鐘。

2. 標準品為凍干粉，所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù)，請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

3. 25×洗液在低溫下可能有結晶，如果發(fā)現(xiàn)有結晶，請37℃溫育使結晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB對人體有刺激性，操作時請注意適當防護，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

5. 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作時請注意適當防護，避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

6. 如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍色，請立即停止使用。

7. 不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試，不能混用。

8. 本試劑盒的操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。

9. 檢測標準品和樣品時建議設置重復孔，以確保檢測結果的可信度。

10. 在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強光照射。

11. 加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。

12. 在操作試劑盒或處理樣本時請穿實驗服，佩戴乳膠或一次性手套。

13. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

14. 為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染，加樣時請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭。

15. 洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。

結果分析

1. 結果計算

為了獲得更準確的實驗結果，建議標準品及樣本進行復孔檢測。計算標準品和樣本的平均OD值，然后減去空白孔的OD值。

以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線，相關系數(shù)R值越接近1，擬合效果越好?；貧w分析確定最佳擬合曲線。

代入樣本檢測OD值，計算出樣本濃度，若樣本進行了稀釋，應乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度。

通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合，可以對標準曲線進行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準確度會降低。

2. 典型數(shù)據(jù)

每次檢測每塊酶標板都必須設立單獨的標準曲線。由于實驗操作條件的不同（如操作者、洗板條件和溫度條件等），每次實驗標準曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標準曲線僅供參考。

檢測步驟概要

1. 實驗前按說明書準備標準品、試劑及樣本；

2. 先加樣（標準品或樣本）100 μL/孔，再加入抗體工作液50 μL/孔，連續(xù)加樣，10分鐘內(nèi)完成?；靹蚝笫覝卣袷?小時；

3. 洗滌5次后拍干，加酶標抗體工作液100 μL/孔，室溫振蕩30分鐘；

4. 洗滌5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室溫避光孵育10－30分鐘；

5. 加終止液50 μL/孔；

6. 10分鐘內(nèi)于450 nm波長處檢測OD值，參考波長630 nm。