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      MitoMaker CMTMRos 是一種細(xì)胞線粒體的橙色熒光探針，具有細(xì)胞膜透性，帶有一個溫和的巰基活性氯甲基基團(tuán)，可用于標(biāo)記線粒體，固定后可保留在線粒體內(nèi)。進(jìn)行線粒體標(biāo)記時，只需將細(xì)胞與 MitoMaker CMTMRos 簡單孵育，探針就可以通過被動擴(kuò)散的形式透過細(xì)胞膜，并在有活性的線粒體內(nèi)富集。一旦線粒體被染料標(biāo)記，再用醛基類固定劑固定細(xì)胞，樣品就可以用于下一步處理。因?yàn)榫€粒體可以在細(xì)胞被固定之前進(jìn)行染色，所以可以借助MitoMaker CMTMRos 解決一些致病性細(xì)胞研究中面臨的困難。

      雖然四甲基羅丹明和羅丹明 123 等傳統(tǒng)的熒光染料可以很容易識別出功能性的線粒體，但是一旦線粒體發(fā)生去極化時，這些染料很容易被沖洗出線粒體。對于需要使用醛類固定劑或其它對線粒體活性有影響的試劑的實(shí)驗(yàn)操作，四甲基羅丹明和羅丹明123 等傳統(tǒng)的熒光染料的使用明顯受到限制，MitoMaker CMTMRos 可以幫助用戶輕易解決這個問題。

產(chǎn)品參數(shù)

      分子式：C24H24Cl2N2O

      分子量：427.37

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞制備與染色

      探針的最佳工作濃度取決于不同的實(shí)驗(yàn)需求，本實(shí)驗(yàn)操作步驟說明中推薦的實(shí)驗(yàn)條件是基于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞類型，用戶應(yīng)根據(jù)具體使用的細(xì)胞類型以及探針對細(xì)胞（組織）等樣品的透性等因素作出調(diào)整優(yōu)化。

      1 配制染色液

      用合適的緩沖液或培養(yǎng)基將 1 mg/ml（大約為 2.3 mM）的染色液稀釋至工作濃度。染色液工作濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求一般在 25~500 nM 范圍，對于需要固定和促滲（透化）處理的細(xì)胞樣品，使用濃度為 100~500 nM。為了避免出現(xiàn)假陽性信號以及染色過度對線粒體產(chǎn)生毒性，請盡可能將染色液稀釋至低濃度使用。

      2 貼壁細(xì)胞的染色

      細(xì)胞生長至所需密度后，加入經(jīng)過預(yù)熱的步驟 1.1 中配制好的染色液，37℃孵育15~45 分鐘；更換預(yù)熱的新鮮緩沖液或培養(yǎng)基，熒光顯微鏡鏡檢或酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果是需要固定的細(xì)胞樣品，繼續(xù)染色后的固定與促滲（透化）處理。

      3 懸浮細(xì)胞的染色

      離心細(xì)胞，棄去上清，用預(yù)熱的步驟 1.1 配制的染色液重懸細(xì)胞，37℃孵育15~45 分鐘；更換預(yù)熱的新鮮緩沖液或培養(yǎng)基，用流式細(xì)胞儀、熒光微孔板讀數(shù)儀、或熒光顯微鏡等設(shè)備進(jìn)行結(jié)果分析。如果要對細(xì)胞進(jìn)行固定，用多聚-D-賴氨酸包被載玻片，繼續(xù)染色后的固定與促滲（透化）處理。

實(shí)驗(yàn)參考

      1 洗滌細(xì)胞：染色完成后，用預(yù)熱的新鮮緩沖液或培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞樣品。

      2 固定細(xì)胞：小心去除多余的緩沖液或培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含 2~4%甲醛的培養(yǎng)基。

      3 沖洗細(xì)胞：完成固定后，用緩沖液反復(fù)沖洗細(xì)胞數(shù)次。

      4 透化處理：可用 TritonX-100 去污劑處理細(xì)胞樣品。如內(nèi)皮細(xì)胞用含 0.2% TritonX-100 in PBS 孵育 10 分鐘，或者在-20℃預(yù)冷的丙酮中浸泡 5 分鐘，再用 PBS 沖洗樣品。

案例分析

注意事項(xiàng)

      為避免反復(fù)凍融，建議適當(dāng)分裝。

      對于微量的液體，每次使用前請先高速離心數(shù)秒，使液體充分沉降到管底。

      熒光染料不可避免的存在淬滅問題，請存放及操作時盡量注意避光，以減緩熒光的淬滅。

      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。