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      Rhod-2是一種高親和力的可見光激發(fā)波長Ca2+熒光探針，波長明顯長于Fluo-3或Fluo-4，其與Ca2+結(jié)合后的大激發(fā)波長為550nm，發(fā)射波長為578nm，這類探針更適用于具高水平自熒光信號的細(xì)胞或組織Ca2+水平檢測，也可用來檢測由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。

      Rhod-2 AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

基本特性

主要特征

      長波長鈣離子探針，能夠與GFP和綠色熒光探針兼容；

      特別定位在線粒體。以羅丹明結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的Rhod-2 AM帶正電荷，以電位驅(qū)動(dòng)的方式吸收聚集在線粒體，熒光顯微鏡下觀察加載進(jìn)入細(xì)胞呈現(xiàn)點(diǎn)狀染色模式。有文獻(xiàn)認(rèn)為，Rhod-2是線粒體Ca2+的選擇性探針，不過這一理論并未得到廣泛支持。

      檢測平臺(tái)：熒光成像，流式細(xì)胞術(shù)，酶標(biāo)儀，高內(nèi)涵篩選（HCS）

Rhod-2 AM的應(yīng)用

      Rhod-2，波長明顯長于Fluo-3/Fluo-4，Ex/Em=552/581nm（Ca2+結(jié)合），更適用于具高水平自熒光信號的細(xì)胞或組織Ca2+水平檢測，也可用來檢測由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放；

使用說明

（1）工作液配制

      1）儲(chǔ)存液配制：產(chǎn)品以粉末形式提供，開蓋前需要經(jīng)過瞬時(shí)離心。如果產(chǎn)品是從冰箱中取出則需要先置于室溫進(jìn)行回溫。取適量 Rhod-2 AM 用無水 DMSO 充分溶解，配制濃度為 1-5 mM 的儲(chǔ)存液。儲(chǔ)存液配置的濃度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。使用者可根據(jù)需要進(jìn)行分裝，儲(chǔ)存于-20℃，注意保持干燥，避光，避免反復(fù)凍融。【注意】：溶劑 DMSO 一定要保證高質(zhì)量無水，否則將會(huì)導(dǎo)致乙酰氧甲酯（AM）水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果。

      2）工作液配制：用合適的緩沖液（如 HBSS）直接稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作液濃度，充分混勻。推薦的工作液濃度為 1-10 μM。使用者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整和配制。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在有效范圍內(nèi)盡量使用最低濃度。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用

      3）（可選）如果 Rhod-2 AM 進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，在配制工作液時(shí)可加入 20% Pluronic F127溶液（終濃度為 0.02% -0.05%），將 Rhod-2 AM 分散在溶液中防止其聚合并能幫助進(jìn)入細(xì)胞。

      【注意】：在配制儲(chǔ)存液的時(shí)候不要加入 Pluronic F127，因?yàn)?Pluronic F127 會(huì)降低 Rhod-2 AM的穩(wěn)定性。

（2）染色步驟

      1）取出培養(yǎng)到合適密度的細(xì)胞，除去舊培養(yǎng)液，使用緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次。細(xì)胞黏附在培養(yǎng)板上或制成細(xì)胞懸液均可。注意：如果使用含血清的培養(yǎng)液，血清中的酯酶會(huì)分解 AM，影響 Rhod-2 AM 進(jìn)入細(xì)胞。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會(huì)使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)液殘留。

      2）將適量的 Rhod-2 AM 工作液加入細(xì)胞中，在 37℃培養(yǎng) 15-60 min，然后除去 Rhod-2 AM工作液。

      3）用緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次，以充分去除殘留的 Rhod-2 AM 工作液。然后加入緩沖液覆蓋細(xì)胞。

      4）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 min，以確保細(xì)胞內(nèi)的 AM 完全去酯化。

      5）熒光顯微鏡觀察染色情況。

      注意，一些細(xì)胞尤其是含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞，會(huì)發(fā)生熒光探針泄漏，此時(shí)需加入一些抑制劑防止這種情況的發(fā)生，可以將丙磺舒（probenecid，2-5 mM）或亞砜吡嗪（sulfinpyrazone，0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中，以減少去酯化探針的泄漏。抑制劑的加入量需要經(jīng)過優(yōu)化，過量會(huì)對細(xì)胞造成不利影響。

注意事項(xiàng)

      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作