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      NBD C6-Ceramide（NBD C6-神經(jīng)酰胺）可以用來研究神經(jīng)鞘脂類的運輸與代謝機(jī)制，也可以用來作為活細(xì)胞或經(jīng)過固定的細(xì)胞樣品內(nèi)高爾基體的選擇性染料。

      NBD C6-Ceramide 是目前應(yīng)用較廣泛的選擇性染色高爾基復(fù)合體的探針。NBD C6-Ceramide 在水溶液中熒光信號非常微弱，但是在非質(zhì)子溶劑或其他非極性溶液中熒光信號增強(qiáng)，最大激發(fā)/發(fā)射波長可達(dá) 466/536 nm。

產(chǎn)品參數(shù)

      分子式：C30H49N5O6

      分子量：575.75

      CAS 號：86701-10-2

實驗步驟

制備 NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物

對于活細(xì)胞或固定細(xì)胞的染色，使用添加 BSA 的 NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物能夠得到較好的染色效果。NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物制備方法如下：

      1 以氯仿：乙醇（體積比 19:1）為溶劑配制 1 mM NBD C6-Ceramide 溶液。

      2 吸取 50 μl NBD C6-Ceramide 溶液于小玻璃試管中，保持干燥，通入氮氣流，然后在真空狀態(tài)保持至少 1 小時，以 200 μl 無水乙醇重溶。

      3 量取 10 ml 無血清的平衡鹽溶液（如 HBSS 或 HEPES，pH 7.4）到 50 ml 塑料離心管中，加入 3.4 mg（使其濃度為 0.34 mg/ml）的脫脂 BSA。

      4 將含有 10 ml BSA 溶液的試管置于漩渦混合器上混勻，加入 200 μl NBD C6-Ceramide 溶液，漩渦震蕩混勻，所得溶液（5 μM NBD C6-Ceramide+5 μMBSA）保存于-20°C。

活細(xì)胞高爾基復(fù)合體染色

      1 用合適的緩沖液（如 HBSS/HEPES）沖洗蓋玻片上的細(xì)胞；

      2 加入 5 μM NBD C6-Ceramide+5 μM BSA 溶液于 4°C 孵育細(xì)胞 30 分鐘；

      3 用預(yù)冷的新鮮培養(yǎng)基反復(fù)沖洗細(xì)胞數(shù)次，37°C 孵育細(xì)胞 30 分鐘。

      4 用新鮮培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，熒光顯微鏡鏡檢。

經(jīng)過固定處理的細(xì)胞高爾基復(fù)合體染色

      注意：染色條件同活細(xì)胞樣品，但應(yīng)避免使用含甲醇/丙酮類的固定劑。

      1 用 HBSS/HEPES 緩沖液沖洗蓋玻片上的細(xì)胞，用 0.5%戊二醛/10%蔗糖/100 mM的 PIPES 緩沖液（pH 7.0）或者 2~4%多聚甲醛（溶于 PBS）溶液室溫下固定5~10 分鐘；

      2 用預(yù)冷的 HBSS/HEPES 反復(fù)沖洗細(xì)胞數(shù)次，加入 5 μM NBD C6-Ceramide+5 μMBSA 溶液于 4°C 冰浴孵育 30 分鐘；

      3 用 HBSS/HEPES 沖洗細(xì)胞樣品，以 10%的 FBS 或者 2 mg/ml 的 BSA 在室溫下孵育 30~90 分鐘，以加強(qiáng)高爾基體染色效果；

      4 用新鮮的 HBSS/HEPES 將細(xì)胞樣品沖洗干凈，熒光顯微鏡鏡檢。

案例分析

注意事項

      為避免反復(fù)凍融，建議適當(dāng)分裝。

      對于微量的液體，每次使用前請先高速離心數(shù)秒，使液體充分沉降到管底。

      熒光染料不可避免的存在淬滅問題，請存放及操作時盡量注意避光，以減緩熒光的淬滅。

      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。