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      目前最常用的蛋白濃度定量檢測方法有兩種，即Bradford法和BCA法。BCA法定量檢測蛋白的基本原理是基于雙縮脲反應(yīng)，即在堿性條件下，Cu2+被蛋白質(zhì)還原成Cu+，隨后Cu+與BCA（Bicinchonic acid，一種顯色劑）發(fā)生螯合反應(yīng)，每兩分子BCA螯合一個Cu+，生成紫色的水溶性復(fù)合物，該物質(zhì)在562 nm處有最高吸收值，且顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度一定范圍內(nèi)成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量檢測，蛋白濃度在50-2000 μg/mL濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

      本方法不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高濃度的去垢劑，包括濃度高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween-20、60、80等。但螯合劑和高濃度還原劑會影響檢測結(jié)果，需確保樣品中無EGTA，EDTA濃度低于10 mM，DTT低于1 mM，β-巰基乙醇低于1 mM。如樣品中含有螯合劑或還原劑，可考慮本公司其他產(chǎn)品ABC2019 Bradford法蛋白定量檢測試劑盒。

儲存與運(yùn)輸

      整套試劑可常溫運(yùn)輸；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）2-8℃保存，有效期12個月。配制成蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液后需-20℃保存，并在6個月內(nèi)使用。其余試劑常溫保存，有效期12個月。

操作步驟

      1. 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。

      2. 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

      3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線。

      4. 準(zhǔn)備待測樣品：將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

      5. 配制BCA顯色工作液：將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費(fèi)。

      6. 檢測：向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）

      7. 計算：以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實(shí)際蛋白濃度。

注意事項(xiàng)

      1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，建議每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

      3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。

      4. 操作時請穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套。