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      目前最常用的蛋白濃度定量檢測方法有兩種，即Bradford法和BCA法。Bradford法原理是基于考馬斯亮藍(lán)G250能與蛋白質(zhì)快速結(jié)合。考馬斯亮藍(lán)G250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488 nm，其與蛋白質(zhì)結(jié)合后在595 nm處有最大吸收值，并且光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量檢測。本方法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達(dá)1 mM，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5 mM；但受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS含量低于0.01%，Triton X-100含量低于0.05%，Tween-20，Tween-60，Tween-80等含量低于0.015%。含去垢劑的樣品推薦使用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒（ABC2044）。

      本試劑盒操作簡便快捷，靈敏度高，檢測速度極快，可檢測蛋白濃度范圍為25-1000μg/mL。

儲存與運(yùn)輸

      整套試劑可常溫運(yùn)輸；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）4℃保存，有效期12個月。配制成蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液后需-20℃保存，并在6個月內(nèi)使用。

操作步驟

      1. 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。

      2. 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

      3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線。

      4. 準(zhǔn)備待測樣品：將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

      5. 檢測：向以上每孔加入200 μL考馬斯亮藍(lán)G250溶液充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），室溫放置3-5 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號做參比，在595 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。

      6. 計算：以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度。

            另：如用分光光度計測定，則在第3步中將梯度標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體積改為1 mL。向7支潔凈的玻璃試管或比色管中分別加入0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度0.5 mg/mL），然后各管中依次分別加入PBS或生理鹽水1.0，0.95，0.9，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，將梯度工作液補(bǔ)足至1 mL，每管充分混勻，即得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線。

            待測蛋白樣品做適當(dāng)稀釋后，加入到新的玻璃試管或比色管中，樣品量為1 mL。

            向上述標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度管及樣品管中各加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液3 mL，充分混勻，室溫靜置3-5 min后用分光光度計進(jìn)行比色檢測。

            檢測時分光光度計波長設(shè)置595 nm，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管為參比調(diào)零，檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品。按照步驟6中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算待測樣品中的蛋白濃度。

注意事項

      1. 考馬斯亮藍(lán)G250溶液使用前需恢復(fù)至室溫，并顛倒混勻，以免影響檢測的靈敏度。

      2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

      3. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。