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      活性氧(ROS)檢測試劑盒，也稱Reactive Oxygen Species Assay Kit或ROS Assay Kit，是一種基于熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA，中文全稱2',7'-二氯熒光素二乙酸酯，分子量487.29，DCFH-DA本身不具有熒光性，可以自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的酯酶水解生成DCFH。DCFH不具有細(xì)胞膜通透性，從而被阻滯在細(xì)胞內(nèi)。無熒光性的DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS氧化生成有熒光的DCF，產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等檢測熒光信號，因此可以間接評判細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

      本產(chǎn)品活性氧(ROS)檢測試劑盒即基于此原理基礎(chǔ)快速有效的對細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行檢測靈敏度高，使用方便。同時提供ROS陽性誘導(dǎo)試劑，能夠在較短時間誘導(dǎo)多類細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以提供陽性樣本。以6孔板每孔加樣量為標(biāo)準(zhǔn)計算，本試劑盒可測定約100次。

儲存與運(yùn)輸

      冰袋運(yùn)輸；-20℃避光保存，12個月有效。

操作步驟

      1. 實(shí)驗前準(zhǔn)備：

            1.1. DCFH-DA工作液配制：將DCFH-DA探針以1:1000比例，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基或Earle’s平衡鹽溶液（ABC4231）稀釋，配制成DCFH-DA工作液；

            1.2. （可選）活性氧陽性誘導(dǎo)劑工作液配制：將活性氧陽性誘導(dǎo)劑（2×）與不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基或Earle’s平衡鹽溶液（ABC4231）1:1體積混合稀釋，配制成1×活性氧陽性誘導(dǎo)劑工作液；

      2. （可選）陽性對照組細(xì)胞準(zhǔn)備：

            2.1. 取狀態(tài)良好的貼壁去除原培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞通過離心去除培養(yǎng)基；

            2.2. 加入1×活性氧陽性誘導(dǎo)劑工作液覆蓋貼壁細(xì)胞或重懸懸浮細(xì)胞，置于37℃ CO₂培養(yǎng)箱中避光孵育45 min（不同細(xì)胞敏感性不同，如果在刺激45 min后觀察不到活性氧的升高，可適當(dāng)延長誘導(dǎo)時間或提高誘導(dǎo)劑濃度，如果活性氧升高得過快，可適當(dāng)減少誘導(dǎo)時間或降低誘導(dǎo)劑濃度）；

      3. 貼壁細(xì)胞活性氧檢測：

            3.1. 細(xì)胞種板：至少提前1日將狀態(tài)良好的細(xì)胞按一定密度均勻接種于孔板中，并根據(jù)實(shí)驗需要對其進(jìn)行藥物或者其他前處理（接種密度由細(xì)胞的大小、生長速度等因素決定，保證檢測時細(xì)胞匯合度在50-70%）；

            3.2. 細(xì)胞洗滌：吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS緩沖液（ABC4220）洗滌1-2次，減少血清、藥物等物質(zhì)對實(shí)驗結(jié)果的干擾：

            3.3. 裝載探針：吸除洗滌緩沖液，參考下表加入對應(yīng)體積的DCFH-DA工作液，置于37℃ CO₂培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。然后吸除DCFH-DA工作液，用PBS緩沖液洗滌2-3次，以充分去除多余的探針；最后用PBS覆蓋細(xì)胞。

            吸除DCFH-DA工作液，用PBS緩沖液洗滌2-3次，以充分去除多余的探針；最后用PBS覆蓋細(xì)胞。

            3.4. ROS檢測：孔板內(nèi)標(biāo)記好的細(xì)胞直接置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察?；蛳笫占?xì)胞用熒光分光光度計、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等儀器的檢測。使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。

      4. 懸浮細(xì)胞活性氧檢測（也適用于前處理后消化重懸的貼壁細(xì)胞）：

            4.1. 細(xì)胞前處理：根據(jù)實(shí)驗需求，選取狀態(tài)良好的細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗需要對其進(jìn)行藥物或者其他前處理后，1000 rpm離心3-5 min收集細(xì)胞（細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)檢測體系、方法以及總量決定，如：流式檢測單份細(xì)胞數(shù)量不少于10⁴）；

            4.2. 細(xì)胞洗滌：用PBS緩沖液洗滌1-2次，1000 rpm離心3-5 min去除上清收集細(xì)胞；

            4.3. 裝載探針：加入一定體積的DCFH-DA工作液，使細(xì)胞密度為1X10⁵ -5X10⁵個/mL，置于37℃ CO²培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。期間每5 min輕輕晃動混勻，以確保探針和細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，1000 rpm離心3-5 min，去除DCFH-DA工作液，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，以充分去除多余的探針。最后用PBS重懸細(xì)胞。

            4.4. ROS檢測：探針標(biāo)記過的細(xì)胞可直接用熒光分光光度計、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測。也可以滴到載玻片上，用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器觀察。使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。

注意事項

      1. 實(shí)驗過程中如果探針標(biāo)記后整體熒光強(qiáng)度過高或過低，可以適當(dāng)調(diào)整DCFH-DA探針的稀釋倍數(shù)以及孵育時間。

      2. 未進(jìn)入細(xì)胞的探針，會導(dǎo)致較高的背景，請盡量洗凈。

      3. 活性氧陽性誘導(dǎo)劑，主要是用于陽性對照組樣品的誘導(dǎo)，根據(jù)實(shí)驗需要選擇是否做陽性對照。

      4. 細(xì)胞每次離心對總細(xì)胞密度會有一定損耗，請注意控制初始細(xì)胞量，以防最后細(xì)胞量不夠檢測的現(xiàn)象。

      5. 由于熒光探針存在猝滅的情況，請盡量縮短探針孵育后到檢測所用的時間（刺激時間除外）。

      6. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實(shí)驗服、戴好手套。