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      本試劑盒通過特別優(yōu)化的裂解緩沖液釋放動(dòng)物組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的核酸，再通過專門為結(jié)合RNA設(shè)計(jì)的超順磁性磁珠特異性地結(jié)合動(dòng)物組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)過漂洗去除磁珠表面殘留的雜質(zhì)，最后洗脫獲得高純度的RNA。本試劑盒無需苯酚、氯仿等有機(jī)試劑，磁吸時(shí)間短，操作簡單，無需多步離心，可從5-20 mg的動(dòng)物組織或新鮮培養(yǎng)細(xì)胞（106-107）中快速提取高純度的RNA。提取的RNA可直接用于RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      Proteinase K，DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其余試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存；有效期12個(gè)月。

使用前準(zhǔn)備

1. Buffer RL如有沉淀現(xiàn)象，請(qǐng)于37℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

2. 操作前請(qǐng)向Buffer RL加入DTT Solution，至終濃度為4%，即1 mL Buffer RL加入40 μL DTT Solution。此裂解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，加入DTT Solution的Buffer RL可在4℃放置一個(gè)月。

3. 使用前請(qǐng)向Buffer RW1和Buffer RW2中加入指定量（見瓶身）的無水乙醇。

4. 按照提取樣本量提前配制60%的異丙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

5. 使用研磨儀研磨組織時(shí)，將研磨儀提前預(yù)冷。

6. 自備磁力架和1.5 mL RNase-free離心管。

操作步驟

1. 樣本裂解：

      a. 動(dòng)物組織：取新鮮、超低溫凍存或組織RNA穩(wěn)定保存液（推薦ABC3037）保存的動(dòng)物組織5-20 mg，置于裝有2-3顆3 mm研磨珠（推薦ABC0221-150G）的1.5 mL RNase-free離心管或?qū)Ｓ醚心ス苤?，立即加?00 μL Buffer RL1（使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入DTT Solution），使用組織研磨儀（推薦ABC901001）在低溫條件下將組織徹底研磨至勻漿狀（如果組織沒有被徹底勻漿，將會(huì)影響RNA的得率和質(zhì)量），再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

      b. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入1.5 mL RNase-free離心管中，1,000 rpm離心5 min，收集懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞（106-107），輕輕吸棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μL Buffer RL1（使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入DTT Solution），用移液器反復(fù)吹打均勻至無明顯沉淀，再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

      c. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：倒出培養(yǎng)液，用1×PBS（pH 7.4）清洗一次。向培養(yǎng)細(xì)胞中加入適量的Buffer RL1（使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入DTT Solution）,水平放置培養(yǎng)皿，使裂解液均勻的分布在細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，然后使用移液器輕輕吹打，使細(xì)胞完全脫落，轉(zhuǎn)移500 μL含有細(xì)胞的裂解液至不同的1.5 mL RNase-free離心管中，再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

2. 將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL RNase-free離心管中，注意盡量不要吸取沉淀；

3. 向離心管中加入等體積的60%異丙醇（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），使用移液器吹打或渦旋振蕩混勻，再加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需重復(fù)振蕩至分散均勻），使用移液器吹打或渦旋振蕩混勻；

4. 室溫靜置10 min，放置過程中，使用移液器吹打混勻數(shù)次，保持磁珠處于懸浮狀態(tài)；

5. 將離心管移至磁力架上靜置30 s，待上清清澈后，吸棄上清；

6. 加入500 μL Buffer RW1，移開磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，待上清清澈后，吸棄上清；

7. 加入500 μL Buffer RW2，移開磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，待上清清澈后，吸棄上清；

8. 移去磁力架，進(jìn)行DNase消化：

a）DNase反應(yīng)液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于新的1.5 mL RNase-free離心管中混勻；

b）向含有磁珠的離心管中加入100 μL DNase反應(yīng)液，使用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫放置15 min，期間每5 min使用移液器混勻一次；

9. 消化結(jié)束后加入500 μL Buffer RW2，使用移液器吹打或渦旋振蕩至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，待上清清澈后，吸棄上清；

10. 重復(fù)步驟9；

11. 將離心管蓋打開，室溫放置5-10 min，使乙醇完全揮發(fā)（避免磁珠過度干燥，以免影響核酸得率）；

12. 移去磁力架，向離心管中加入50-100 μL Nuclease-free Water，使用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置5 min；

13. 將離心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的1.5 mL RNase-free離心管中，即得高純度的RNA。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 磁珠懸液在保存過程中應(yīng)避免冷凍；磁珠易沉降，使用前應(yīng)充分振蕩使其保持均勻懸浮狀態(tài)。

3. 向樣本中加入磁珠前，需要將樣本中的試劑混合均勻。

4. 洗脫RNA前應(yīng)使乙醇完全揮發(fā)，避免殘留的乙醇影響下游實(shí)驗(yàn)。

5. 請(qǐng)勿長時(shí)間干燥磁珠，以免影響RNA洗脫效率。

6. 實(shí)驗(yàn)時(shí)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用RNase-free的吸頭和離心管避免交叉污染。