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      本試劑盒采用專為核酸提取和純化設(shè)計(jì)的超順磁性磁珠提取新鮮血液樣本的總RNA。本試劑盒通過特別優(yōu)化的裂解液在去除紅細(xì)胞后裂解白細(xì)胞釋放其中的核酸，再通過具有分離作用的超順磁性磁珠在一定條件下吸附RNA，改變條件后磁珠釋放吸附的RNA，即可獲得高純度的RNA。不需要苯酚、氯仿等試劑，能夠快速從小于1.5 mL的全血中提取高純度RNA。提取的RNA可直接用于RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其他試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存；有效期12個(gè)月。

使用前準(zhǔn)備

1. Buffer BRL如有沉淀，請(qǐng)于37℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

2. 使用前請(qǐng)向Buffer BRL加入DTT Solution，至終濃度為4%，即1 mL Buffer BRL加入40 μL DTT Solution。此裂解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，加入DTT Solution的Buffer BRL可在4℃放置一個(gè)月。

3. 使用前請(qǐng)向Buffer RW1加入18 mL無水乙醇，向Buffer RW2中加入72 mL的無水乙醇。

4. 自備磁力架。

操作步驟

1. 紅細(xì)胞裂解液稀釋：使用Nuclease-free Water將10×Red cell Lysis Buffer稀釋至1×備用（當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要取140 μL 10×Red cell Lysis Buffer進(jìn)行稀釋）；

2. 取1體積的血液樣本加入5體積的1×Red cell Lysis Buffer，混勻。如：當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要加入1 mL 1×Red cell Lysis Buffer；

3. 置于冰上孵育15 min，期間上下顛倒混勻2-3次，當(dāng)溶液變?yōu)榘胪该鲿r(shí)，說明紅細(xì)胞裂解完全。根據(jù)血液樣本裂解的程度不同，可以將孵育時(shí)間延長至20 min；

4. 3,000 rpm，4℃離心10 min，將上清完全去除，請(qǐng)勿將白細(xì)胞沉淀吸出；

5. 向白細(xì)胞沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Red cell Lysis Buffer（如：當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要加入400 μL 1×Red cell Lysis Buffer），懸浮白細(xì)胞沉淀。；

6. 3,000 rpm，4℃離心10 min，將上清完全去除，勿將白細(xì)胞沉淀吸出；

7. 根據(jù)血液樣本體積加入Buffer BRL懸浮白細(xì)胞沉淀（使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入DTT Solution）。當(dāng)血液樣本量小于0.5 mL時(shí)，加入400 μL Buffer BRL；當(dāng)血液樣本量為0.5-1.5 mL時(shí)，加入600 μL Buffer BRL；

8. 向離心管中加入2/3體積異丙醇，上下顛倒混勻，再加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需渦旋振蕩至分散均勻），使用移液器吹打至磁珠分散均勻；

9. 室溫靜置10 min，放置過程中，使用移液器吹打混勻3-5次；

10. 將離心管移至磁力架上靜置30 s，再將離心管隨磁力架一起緩慢上下顛倒數(shù)次，將管壁殘留的磁珠沖刷下來，待上清清澈后，吸棄上清；

11. 加入500 μL Buffer RW1，移開磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，再將離心管隨磁力架一起緩慢上下顛倒數(shù)次，將管壁殘留的磁珠下來，待上清清澈后，吸棄上清；

12. 加入500 μL Buffer RW2，移開磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，再將離心管隨磁力架一起緩慢上下顛倒數(shù)次，將管壁殘留的磁珠沖刷下來，待上清清澈后，吸棄上清；

13. 移去磁力架，進(jìn)行DNase消化：

      a） DNase反應(yīng)液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于Nuclease-free離心管中混勻；

      b） 向含有磁珠的離心管中加入100 μL DNase反應(yīng)液，使用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置15 min，期間每5 min使用移液器吹打混勻一次；

      c） 消化結(jié)束后加入600 μL Buffer RW2，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，將離心管移至磁力架上靜置30 s，再將離心管隨磁力架一起緩慢上下顛倒數(shù)次，將管壁殘留的磁珠沖刷下來，待上清清澈后，吸棄上清；

14. 重復(fù)步驟12；

15. 將離心管蓋打開，室溫晾干5-10 min，使乙醇完全揮發(fā)（避免磁珠過度干燥，以免影響核酸得率）；

16. 移去磁力架，向離心管加入30-50 μL Nuclease-free Water，使用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置5 min；

17. 將離心管移至磁力架上至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的Nuclease-free離心管中，即得高純度的RNA。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 本試劑盒的最大樣品處理量為1.5 mL（白細(xì)胞數(shù)量1×10⁷），如果血液中白細(xì)胞含量較高，可以按比例減少血液用量。

3. 本試劑盒適用于常規(guī)抗凝劑（包括肝素鈉、EDTA、枸櫞酸鈉等）保存的血液RNA提取。

4. 磁珠懸液在保存過程中應(yīng)避免冷凍操作；磁珠易沉降，使用前應(yīng)充分振蕩使其保持均勻的懸浮狀態(tài)。

5. 加入磁珠前，需要將其他試劑混合均勻。

6. 洗脫RNA前應(yīng)使乙醇完全揮發(fā)，避免殘留的乙醇影響下游實(shí)驗(yàn)。

7. 請(qǐng)勿長時(shí)間干燥磁珠，以免影響RNA洗脫效率。

8. 實(shí)驗(yàn)時(shí)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用Nuclease-free的槍頭、離心管。

9. 應(yīng)使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)與電泳設(shè)備。