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      本試劑盒適用于福爾馬林固定、石蠟包埋組織（FFPE）的RNA提取，采用特殊的脫蠟試劑，不含二甲苯等有機(jī)溶劑，安全無毒，可有效地去除石蠟并釋放出組織樣本。本試劑盒利用特殊的裂解緩沖液能高效地裂解組織并利用超順性磁珠特異結(jié)合RNA，可快速、有效地提取出組織中RNA，提取過程可在1 h內(nèi)完成，RNA產(chǎn)量大，純度和完整程度高，適用于RT-PCR和Real-Time PCR等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      DNase和Proteinase K冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其它試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。

使用前須知（請(qǐng)仔細(xì)閱讀）

1. 提前準(zhǔn)備好80℃和55℃的水浴或加熱塊。

2. 如果Buffer FRL和Buffer MRB出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

3. DNase工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 使用前請(qǐng)向Buffer RW1中加入22 mL的無水乙醇，向Buffer RW2中加入64 mL的無水乙醇，混合均勻后使用。

5. 自備磁力架。

操作步驟

1. 樣本處理

      I. 石蠟切片：取石蠟切片（5-10 μm厚，1×1 cm²大?。?-8張，若樣本暴露于空氣中，則表面的2-3張丟棄不用。

      II. 石蠟塊：用滅菌手術(shù)刀刮取約30 mg的組織樣本，盡量去除多余的石蠟并切碎樣本。

      III. 福爾馬林浸泡的樣本組織：用濾紙吸干樣本表面的液體，取約30 mg樣本，切碎并置于1.5 mL離心管中，加入500 μL 1×PBS緩沖液（pH 7.4），渦旋振蕩10 s后12,000 rpm室溫離心1 min，棄上清，重復(fù)3次。

2. 將樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入500 μL Buffer DP，80℃孵育3 min，趁熱渦旋振蕩10 s；

3. 向離心管中加入200 μL Buffer FRL，渦旋振蕩混勻，12,000 rpm室溫離心1 min，溶液形成上下兩層（上層為油相，下層為水相）；

4. 于下層水相中加入20 μL Proteinase K，使用移液器輕輕吹打混勻（盡量不要破壞分層），55℃孵育15 min；

5. 隨后將離心管轉(zhuǎn)移至80℃孵育15 min（若只有一個(gè)加熱模塊，此步請(qǐng)將含樣本的離心管先置于室溫，當(dāng)加熱模塊溫度達(dá)到80℃后再將離心管放入加熱模塊中），上下顛倒混勻；

6. 12,000 rpm室溫離心5 min，溶液形成上下兩層（上層為油相，下層為水相）；

7. 取下層水相溶液至一新的Nuclease-free 1.5 mL離心管中（不要取到上層油相溶液和其他雜質(zhì)），加入等水相體積的Buffer MRB和3倍水相體積的無水乙醇（可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），使用移液器吹打混勻；

8. 向離心管中加入30 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需渦旋至分散均勻），使用移液器吹打至磁珠分散均勻；

9. 室溫放置5 min，期間使用移液器吹打混勻2-3次，使磁珠保持分散均勻的狀態(tài)；

10. 將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附至管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出），將離心管從磁力架上取下；

11. 配制DNase工作液：取80 μL Nuclease-free Water，10 μL 10×DNase Reaction Buffer和10 μL DNase于一新的Nuclease-free離心管中，使用移液器輕輕吹打混勻；

12. 將DNase工作液加入到含磁珠的離心管中，使用移液器輕輕吹打混勻，室溫放置15 min，期間使用移液器吹打混勻2-3次；

13. 向離心管中加入500 μL Buffer RW1，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，再將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出）；

14. 將離心管從磁力架上取下，向離心管中加入600 μL Buffer RW2，用移液器吹打至磁珠分散均勻，再將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出）；

15. 重復(fù)操作步驟14；

16. 將離心管蓋打開，室溫放置5–10 min，使乙醇完全揮發(fā)（請(qǐng)勿使磁珠過度干燥，以免影響核酸得率）；

17. 將離心管從磁力架上取下，向離心管中加入50-100 μL Nuclease-free Water，用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置3 min；

18. 將離心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的Nuclease-free離心管中，即得高純度的RNA。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 本試劑盒提取RNA的得率和完整性依賴于樣本種類，固定時(shí)間、固定條件以及樣本儲(chǔ)存時(shí)間等。固定時(shí)間最好在8-24 h以內(nèi)，如果樣本固定時(shí)間超過24小時(shí)或者存放時(shí)間超過1年，則可能會(huì)導(dǎo)致RNA大量降解。

3. 樣本包埋前需完全脫水，以防止殘留的福爾馬林對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。

4. 包埋組織取樣時(shí)應(yīng)盡量去除多余的石蠟并切碎樣本，且取樣量不要超過30 mg，否則易造成裂解不充分的情況，影響核酸得率。

5. 磁珠易沉淀，使用前應(yīng)搖勻或渦旋混勻，磁珠懸液在保存過程中應(yīng)避免冷凍。

6. 洗脫RNA前應(yīng)使乙醇完全揮發(fā)，避免殘留的乙醇影響下游實(shí)驗(yàn)，但請(qǐng)勿長時(shí)間干燥磁珠，以免影響RNA洗脫效率。

7. FFPE樣本中純化的核酸不建議用于需要全長RNA的下游應(yīng)用。

8. 實(shí)驗(yàn)時(shí)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用Nuclease-free的槍頭和離心管以避免交叉污染。

9. 應(yīng)使用RNA提取專用操作實(shí)驗(yàn)臺(tái)與電泳設(shè)備。