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      本試劑盒適用于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的RNA提取，利用超順性磁珠可逆的結(jié)合核酸的特性，再搭配精心優(yōu)化的裂解緩沖液體系，可快速、有效地分離出細(xì)菌中的RNA，提取過程可在30-40 min內(nèi)完成，得到的RNA完整性好、純度高、產(chǎn)量大，適用于RT-PCR、Real-Time PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA篩選、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆等多種下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      Lysozyme（50 mg/mL）、DTT solution和DNase冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其它試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。

使用前準(zhǔn)備

1. 請(qǐng)自備10 mM Tris-HCl（pH 8.0），用于重懸收集的細(xì)菌菌體和稀釋溶菌酶。

2. 若提取革蘭氏陽(yáng)性菌RNA，請(qǐng)?zhí)崆皽?zhǔn)備37℃的水浴或加熱塊。

3. 若Buffer GRL出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于37℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

4. 請(qǐng)?jiān)谑褂们跋駼uffer GRL加入DTT Solution至4%，即每1 mL Buffer GRL加40 μL DTT Solution，最好現(xiàn)用現(xiàn)配，加入DTT Solution的Buffer GRL可于4℃保存1周。

5. DNase工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

6. 使用前請(qǐng)向Buffer RW1中加入18 mL無水乙醇，混合均勻后使用。

7. 使用前請(qǐng)向Buffer RW2中加入64 mL無水乙醇，混合均勻后使用。

操作步驟

1. 取1-3 mL菌液（細(xì)菌總量不超過1×10⁹），12,000 rpm（~13,400×g）4℃離心2 min收集菌體；

      注：上清請(qǐng)務(wù)必去除干凈，否則會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞壁的消化。

      注：菌體不宜過量，否則會(huì)造成產(chǎn)量降低、基因組殘留以及蛋白污染等問題，當(dāng)OD600=1時(shí)建議取1 mL的菌液量。

2. 將菌體重懸于100 μL含溶菌酶的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中，溶菌酶濃度及孵育條件見下表：

3. 向孵育后的細(xì)菌懸液中加入200 μL Buffer GRL（使用前請(qǐng)確認(rèn)已加入DTT solution），渦旋振蕩混勻；

4. 向離心管中加入300 μL無水乙醇，使用移液器吹打混勻（可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）；

5. 向混合液中加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需渦旋至分散均勻），使用移液器吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置5 min，期間使用移液器吹打混勻2-3次，使磁珠保持分散均勻的狀態(tài)；

6. 將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附至管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出），將離心管從磁力架上取下；

7. 向離心管中加入500 μL Buffer RW1，使用移液器吹打至磁珠分散均勻，再將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出），將離心管從磁力架上取下；

8. 向離心管中加入600 μL Buffer RW2，用移液器吹打至磁珠分散均勻，再將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出），將離心管從磁力架上取下；

9. 配制DNase工作液：取85 μL Nuclease-free Water、10 μL 10×DNase Buffer和5 μL DNase置于一新的Nuclease-free離心管中，使用移液器輕輕吹打混勻；

10. 將DNase工作液沿管壁加入到離心管中，將管壁的磁珠沖刷下來并使用移液器輕輕吹打混勻，室溫放置15 min，期間使用移液器多次吹打混勻；

11. 向離心管中加入600 μL Buffer RW2，用移液器吹打至磁珠分散均勻，再將離心管移至磁力架上靜置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸棄上清（為避免影響提取效率，勿將磁珠吸出）；

12. 重復(fù)操作步驟11；

13. 將離心管蓋打開，置于超凈工作臺(tái)中放置5–10 min，使乙醇完全揮發(fā)（請(qǐng)勿使磁珠過度干燥，以免磁珠結(jié)塊影響核酸得率）；

14. 將離心管從磁力架上取下，向離心管中加入50-100 μL Nuclease-free Water，用移液器輕輕吹打至磁珠分散均勻，室溫靜置3-5 min，期間使用移液器吹打混勻2-3次；

15. 將離心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的離心管中，即得高純度的RNA；

16. 得到的RNA溶液請(qǐng)于-80℃保存。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，提取RNA過程中所使用的器具和配制溶液所用的水或試劑請(qǐng)確保為Nuclease-free的制品。

3. 不同細(xì)菌細(xì)胞壁的酶解難易程度不同，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁一般較難酶解，客戶可根據(jù)細(xì)菌種類調(diào)整溶菌酶濃度和孵育時(shí)間。

4. 部分試劑易揮發(fā)和氧化，應(yīng)避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，各試劑使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

5. 應(yīng)使用RNA提取專用操作實(shí)驗(yàn)臺(tái)與電泳設(shè)備。