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      通過分析細(xì)胞增殖能力來判斷某些基因、藥物等對體外培養(yǎng)的細(xì)胞影響，或者分析不同狀態(tài)或刺激干預(yù)下生物個(gè)體組織細(xì)胞的生長和更新能力，是生命學(xué)科中一種常見且重要的評估手段。目前檢測細(xì)胞增殖的方法有很多，大部分是利用細(xì)胞產(chǎn)生的一些代謝酶類，來間接評定細(xì)胞的增殖活性（如CCK-8法、MTT法等），但是一些藥物或細(xì)胞本身狀態(tài)等因素都會(huì)對評定的結(jié)果造成一定影響。直接檢測細(xì)胞中DNA合成，來判斷細(xì)胞的增殖是公認(rèn)的最精確且有效的檢測方法。但是不論是最初使用的放射性標(biāo)記核苷摻入法，還是后續(xù)改進(jìn)的基于抗體檢測的BrdU法，都有著一定的自身局限性。

      EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種含有一個(gè)乙炔基團(tuán)的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，當(dāng)將其注射到動(dòng)物體內(nèi)或者對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行孵育，這些小分子能夠迅速擴(kuò)散到各個(gè)器官組織，并滲入到細(xì)胞中，可以在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸苷（T）摻入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基團(tuán)能與熒光標(biāo)記的疊氮化合物探針在銅離子催化下發(fā)生“點(diǎn)擊”反應(yīng)形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，因此可以使新合成的DNA被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記。EdU檢測法同放射性標(biāo)記核苷摻入法相比，沒有放射性污染等限制因素；同BrdU檢測法相比，EdU檢測法不需要DNA的變性處理，也不用抗原抗體反應(yīng)，這大大減少了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和時(shí)間，也使其變得更省時(shí)、更靈敏、更穩(wěn)定和更準(zhǔn)確。本試劑盒可用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞或動(dòng)物組織中細(xì)胞增殖情況。本試劑盒中熒光探針為紅色熒光，最大激發(fā)波長為593 nm，最大發(fā)射波長為614 nm，處于增殖的細(xì)胞被標(biāo)記后，細(xì)胞核會(huì)顯示出明亮的紅色熒光，通過配套常規(guī)細(xì)胞核染料共同標(biāo)記細(xì)胞核（本試劑盒提供Hoechst 33342細(xì)胞核染料），可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細(xì)胞增殖情況；也可以使用流式細(xì)胞儀檢測體外培養(yǎng)細(xì)胞群熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度，來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋（wet ice）運(yùn)輸；-20℃避光保存，EdU催化試劑（試劑A）、反應(yīng)緩沖液可4℃保存；有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

      1. 含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基；

      2. 通透液：含0.2-0.5% Triton X-100 的緩沖液（推薦ABC1222）；

      3. 固定液：4%多聚甲醛（推薦ABC1119）或其他類似用途的試劑；

      4. PBS緩沖液（推薦ABC4220）；

      5. 超純水；

      6. 動(dòng)物造模以及組織切片相關(guān)試劑（動(dòng)物組織細(xì)胞增殖檢測）。

操作步驟

      1. 體外細(xì)胞樣品以及試劑準(zhǔn)備工作：

            1.1. 將細(xì)胞按一定密度均勻種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中（種植密度，由細(xì)胞大小、生長快慢等因素決定），待細(xì)胞貼壁或恢復(fù)正常狀態(tài)后，進(jìn)行相應(yīng)的藥物刺激等處理（如檢測懸浮細(xì)胞，請按懸浮細(xì)胞常規(guī)操作方式進(jìn)行，整體實(shí)驗(yàn)均需添加離心等步驟）。

            1.2. 催化添加劑（試劑C）低速離心，取100mg加入1 mL超純水溶解，并分裝后于-20℃存放，剩余粉末留作備用。

      2. 體外細(xì)胞EdU標(biāo)記、固定及通透：

            2.1. 配制2×EdU孵育工作液：每1 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2 μL EdU存儲(chǔ)液（10 mM），即為20 μM的2×EdU孵育工作液，并放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)以EdU工作濃度為10 μM進(jìn)行摸索）；

            2.2. 以半換液的模式，將培養(yǎng)板中原細(xì)胞培養(yǎng)基吸除一半，并補(bǔ)加等體積預(yù)熱的2×EdU孵育工作液，孵育一定的時(shí)間（孵育的時(shí)間一般取決于對應(yīng)的細(xì)胞生長周期，通常占細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對于大多貼壁且生長較快的細(xì)胞，建議孵育2 h左右。具體情況，需要隨細(xì)胞特性、處理后實(shí)際情況等進(jìn)行調(diào)整。如需孵育較長時(shí)間可適當(dāng)降低EdU工作濃度；較短時(shí)間則可適當(dāng)提高EdU濃度）；

            2.3. 將EdU標(biāo)記孵育后的細(xì)胞樣品，用PBS緩沖液清洗1-2次后，加入固定液，覆蓋細(xì)胞即可，室溫固定15 min（如需用流式檢測，貼壁細(xì)胞此步之前先消化重懸后再固定，后續(xù)按懸浮細(xì)胞的處理方式即可）；用PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5 min；

            2.4. 去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育15 min；

            2.5. 去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟4。

      3. 動(dòng)物EdU注射造模以及組織切片處理：

            3.1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對動(dòng)物進(jìn)行一次或多次EdU注射造模，一般實(shí)驗(yàn)EdU用量和動(dòng)物體重的比值為5 mg/kg，具體注射量根據(jù)研究內(nèi)容和動(dòng)物情況而定。本試劑盒中提供部分EdU儲(chǔ)存液，主要用于體外細(xì)胞EdU標(biāo)記，如需對動(dòng)物進(jìn)行EdU造模，可單獨(dú)訂購EdU試劑（推薦ABC5077）；

            3.2. 小腸等上皮組織細(xì)胞增殖速度快，大腦等組織細(xì)胞增殖速度慢，生長較快的組織部位通常標(biāo)記時(shí)間小于12小時(shí)，而生長較慢的組織標(biāo)記時(shí)間可能需幾天；最佳標(biāo)記時(shí)間根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定，由于小腸上皮組織增殖較快，建議取該類組織作為標(biāo)記參考；

            3.3. 將造模動(dòng)物按照規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)處死后，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片；

                  a. 對于冰凍切片：放置恢復(fù)到室溫，加入適量固定液，室溫固定15 min。去除固定液，用適量PBS緩沖液洗滌3次，每次3-5 min；去除PBS緩沖液，用適量通透液覆蓋組織室溫孵育10-15 min；去除通透液，用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟4。

                  b. 對于石蠟切片：切片脫蠟復(fù)水，PBS洗滌5 min。去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育15 min；去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟4。

      4. EdU點(diǎn)擊反應(yīng)：

            4.1. 在細(xì)胞或組織固定和穿孔期間，配制點(diǎn)擊反應(yīng)液（對于不同樣本配制體系參考以下表中方案）

對于體外培養(yǎng)細(xì)胞：本參考步驟是對應(yīng)10個(gè)96孔板樣品的體積用量（每孔100 μL），可根據(jù)使用需求，等比例增加或減少配制量，請按下表順序依次添加組分，邊加邊混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）；

對于組織細(xì)胞切片：參考下體系進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)液體系的配制，可根據(jù)切樣本數(shù)，等比例增加或減小配制量，每個(gè)切片樣本約用100-200 μL的點(diǎn)擊反應(yīng)液覆蓋。

            4.2. 去除上一步（步驟2.5或3.3）PBS緩沖液，加入點(diǎn)擊反應(yīng)液，輕搖保證反應(yīng)液全部覆蓋細(xì)胞或組織，室溫避光孵育30 min；

            4.3. 去除點(diǎn)擊反應(yīng)液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5 min（如無其他特別要求，即可用流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度或用其他儀器檢測熒光效果）。

      5. 細(xì)胞核染色：

            5.1. 去除上一步PBS緩沖液，將Hoechst 33342染色液與PBS緩沖液以1比500-1000比例稀釋后，加入覆蓋細(xì)胞，孵育5 min；

            5.2. 去除Hoechst 33342染色液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5 min。

      6. 成像以及檢測分析

            直接將體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測，分析處于增殖的細(xì)胞占比；或者收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度（建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓），根據(jù)熒光強(qiáng)度，來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。本試劑盒熒光染料iF488（試劑B）對應(yīng)的光譜特性為Ex/Em：491 nm/516 nm（綠色）；Hoechst 33342染色液對應(yīng)的光譜特性為Ex/Em：346 nm/460 nm（藍(lán)色）。

注意事項(xiàng)

      1. 對于體外培養(yǎng)細(xì)胞，具體EdU使用濃度、孵育時(shí)間隨樣品以及研究目的的不同，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

      2. 部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作為參照樣本（如腸道組織）。

      3. 如果背景顏色過深，可能是實(shí)驗(yàn)中洗滌不充分、組織樣品固定時(shí)間過長、固定液殘余導(dǎo)致。

      4. EdU催化添加試劑（試劑C）易氧化，盡量避免長時(shí)間暴露于空氣中，配制成水溶液后，建議分裝保存；經(jīng)測試，如EdU催化添加試劑顏色發(fā)生輕微變化，點(diǎn)擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進(jìn)行，如呈現(xiàn)棕色，表明該組分已失效，請棄用。

      5. 操作時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。