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      Calcein AM是在Calcein（鈣黃綠素）的基礎(chǔ)上，引入了一個(gè)乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，AM基團(tuán)不僅掩蓋了Calcein螯合鈣的分子部分且增強(qiáng)了其疏水性，因此可以使Calcein AM輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)源性酯酶剪切為Calcein。失去AM基團(tuán)的Calcein不能輕易通過(guò)細(xì)胞膜，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)；此外螯合鈣的分子部分被暴露出來(lái)，使得Calcein探針和活細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，并發(fā)出較強(qiáng)綠色熒光。而死細(xì)胞缺乏酯酶，并不能使Calcein AM被水解成能Calcein，故無(wú)法標(biāo)記死細(xì)胞。Calcein AM細(xì)胞毒性低，對(duì)細(xì)胞功能影響較小，如細(xì)胞增殖或淋巴細(xì)胞的趨化性等，是一款非常適用于活細(xì)胞染色的熒光探針。

      本產(chǎn)品Calcein AM細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒也被稱為細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Fluorescence Counting Kit，CCK-F），是通過(guò)Calcein AM熒光探針標(biāo)記活細(xì)胞，來(lái)評(píng)判細(xì)胞的活性、毒性、增殖的檢測(cè)試劑盒。本試劑盒經(jīng)過(guò)優(yōu)化和調(diào)試，不僅檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬，且只需要短時(shí)間的孵育，便可完成對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)。操作簡(jiǎn)單，不需要放射性同位素標(biāo)記、也不需要結(jié)晶溶解等步驟，可減少實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)的誤差，提高準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋(wet ice)運(yùn)輸；

      -20℃保存，Calcein AM溶液需避光保存，并盡量避免反復(fù)凍融；12個(gè)月有效。

操作步驟

      1. Calcein AM檢測(cè)工作液配制：

      根據(jù)96孔板每孔100 μL使用量，參考下表，將Calcein AM溶液和CCK-F檢測(cè)緩沖液按比例混合，配制成Calcein AM檢測(cè)工作液。

      2. 貼壁細(xì)胞檢測(cè)：

以下步驟主要對(duì)應(yīng)96孔板檢測(cè)方案，其他孔板體系需視情況進(jìn)行調(diào)整。

            a. 細(xì)胞種板：將細(xì)胞按一定密度均勻接種于96孔板中，對(duì)其進(jìn)行藥物或者其他前處理（接種密度由細(xì)胞的大小、生長(zhǎng)速度等因素決定）；

            b. （選做）細(xì)胞洗滌：吸取原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液（推薦ABC4220）洗滌1-2次，減少血清、酚紅或者藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；

            c. 探針標(biāo)記：去除細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS緩沖液后，加入100 μL Calcein AM檢測(cè)工作液，于37℃避光孵育30 min；

            d. （選做）細(xì)胞孵育：更換細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育15-30 min，以確保細(xì)胞內(nèi)Calcein AM充分水解；

            e. 熒光檢測(cè)：使用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光讀數(shù)，Calcein AM探針最大激發(fā)光波長(zhǎng)為501 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為521 nm。細(xì)胞活性與熒光強(qiáng)度成正比。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，也可進(jìn)一步復(fù)染細(xì)胞核或使用其他儀器（例如熒光顯微鏡）檢測(cè)。

      1. 懸浮細(xì)胞檢測(cè)：

            a. 細(xì)胞接種：將細(xì)胞按一定密度均勻接種于24孔板中，對(duì)其進(jìn)行藥物或者其他前處理（接種密度由細(xì)胞的大小、生長(zhǎng)快慢等因素決定）；

            b. （選做）細(xì)胞洗滌：1000 g離心3-5 min去除原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次需要1000 g離心3-5 min，以減少血清、酚紅或者藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；

            c. 探針標(biāo)記：1000 g離心3-5 min后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS緩沖液，加入適量Calcein AM檢測(cè)工作液，于37℃避光孵育30 min；

            d. （選做）細(xì)胞孵育：更換細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育15-30 min，以確保細(xì)胞內(nèi)Calcein AM充分水解；

            e. 熒光檢測(cè)：使用酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)，Calcein AM探針最大激發(fā)光波長(zhǎng)為501 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為521 nm。細(xì)胞活性與熒光強(qiáng)度成正比。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，也可以進(jìn)一步復(fù)染細(xì)胞核或用其他儀器（例如熒光顯微鏡）檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

      1. Calcein AM溶液在使用前進(jìn)行短時(shí)離心，以減少試劑損失。

      2. Calcein AM溶液避免反復(fù)凍融，收到產(chǎn)品后建議適當(dāng)分裝，于-20℃避光密封保存。

      3. Calcein AM在水溶液中不穩(wěn)定，Calcein AM檢測(cè)工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，24 h內(nèi)有效。

      4. 由于不同細(xì)胞狀態(tài)不同，Calcein AM檢測(cè)工作液孵育的時(shí)間和濃度可以視情況進(jìn)行調(diào)整。

      5. 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度時(shí)，請(qǐng)使用黑色細(xì)胞培養(yǎng)板。

      6. 熒光染料存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)避光操作和存放。

      7. 為了您的健康和安全，操作時(shí)請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好手套。