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      乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑的末端酶，廣泛存在于動物、植物、微生物中，參與催化丙酮酸和乳酸之間的可逆反應(yīng)。通常LDH在細胞胞漿內(nèi)含量豐富，正常細胞由于細胞膜的屏障保護作用，胞內(nèi)LDH不能隨意通過細胞膜。但當細胞受到損傷或者死亡時，細胞膜的屏障保護作用消失，細胞內(nèi)的LDH被釋放至培養(yǎng)液中。通過檢測細胞膜破裂釋放到培養(yǎng)液中的LDH含量，即可對細胞毒性進行定量分析。

      乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒主要原理是利用LDH將NAD+被還原成NADH，進一步NADH和INT（四唑鹽）在Diaphorase（硫辛酰胺脫氫酶）催化下，生成NAD+和紅色甲臜，甲臜產(chǎn)生的量和LDH的含量成線性正相關(guān)，且能夠在490 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，因此可以通過儀器進行定量分析。本試劑盒主要用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測，同時也可用于以細胞總LDH為基礎(chǔ)的細胞增殖和毒性檢測。

儲存與運輸

      冰袋(wet ice)運輸；-20℃保存，INT溶液需避光保存，酶溶液避免反復(fù)凍融；12個月有效。

操作步驟

      1. 樣品前準備：

            1) LDH釋放檢測樣品準備：

                  a. 細胞接種：將細胞以合適的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，可根據(jù)實驗需求設(shè)置多個分組，例如：背景空白對照孔（僅含細胞培養(yǎng)基）、樣品對照孔（未經(jīng)處理的細胞孔）、樣品最大酶活性對照孔（未處理孔，細胞裂解后測胞內(nèi)總LDH量）、處理樣品孔（實驗組）等；

                  b. 細胞處理：根據(jù)實驗設(shè)計，除去原有培養(yǎng)基，使用PBS緩沖液（推薦ABC4220）洗滌一次，根據(jù)分組換上對應(yīng)的含藥物或者不含藥物的無血清或低血清培養(yǎng)基，并孵育一定時間；

                  c. 樣本收集：將細胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min，取80 μL培養(yǎng)上清液，加到新的96孔板中，隨后對樣品進行測定（樣品最大酶活性對照孔的樣品準備工作，請參考細胞內(nèi)總LDH檢測樣品準備步驟）。

            2) 細胞內(nèi)總LDH檢測樣品準備：

                  a. 細胞接種：將細胞以合適的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，可根據(jù)實驗需求設(shè)置多個分組；

                  b. 細胞處理：根據(jù)實驗設(shè)計，使用含藥物或者不含藥物的培養(yǎng)基（可含血清）孵育細胞；

                  c. 細胞裂解：達到預(yù)定時間后，去除原培養(yǎng)基，用PBS洗滌一遍，加入120 μL細胞裂解工作液（10×細胞裂解液使用PBS稀釋10倍），并于培養(yǎng)箱中孵育30-60 min；

                  d. 樣本收集：將細胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min，取80 μL裂解上清液加到新的96孔板中，隨后進行測定。

            3) （選做）LDH標準樣品準備：

                  如需對LDH酶活性的進行絕對定量，請自行購買和配制不同濃度LDH標準品，濃度可設(shè)置為10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。以每孔80 μL，梯度加至96孔板中。

      2. LDH檢測：

            1) 根據(jù)待測樣品數(shù)量，參考下表配制適量的LDH檢測工作液（主要對應(yīng)96孔板檢測，其他規(guī)格的孔板，可視情況進行調(diào)整）；

            2) 將LDH檢測工作液，加入到待檢測樣品孔中，每孔80 μL（樣本與LDH檢測工作液體積比為1:1），輕敲混均；

            3) 將其放入細胞培養(yǎng)箱中，避光孵育30 min，也可用錫箔紙包裹，室溫于水平搖床上孵育30 min；

            4) 使用酶標儀，在490 nm處測定吸光度?？墒褂?00 nm或大于600 nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。

      3. LDH結(jié)果計算：

            1) 常規(guī)LDH（釋放）細胞毒性檢測：

                  a. 將樣品對照孔、樣品最大酶活性對照孔、處理樣品孔等OD490減去背景空白對照孔OD490，并用于后續(xù)的計算；

                  b. 細胞毒性或死亡率計算（%）=（處理樣品孔OD490－樣品對照孔OD490）/（樣品最大酶活性對照孔OD490－樣品對照孔OD490）×100%

            2) LDH酶活性的相對定量（根據(jù)計算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學(xué)差異等）：

                  a. 測定一個已知濃度的LDH標準品OD490；

                  b. 待測樣品LDH活性（mU/mL）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490）/（標準品OD490－背景空白對照孔OD490）×標準品濃度（mU/mL）

            3) LDH酶活性的絕對定量:

                  a. 測定一系列LDH梯度標準品OD490，根據(jù)所得的吸光值繪制標準曲線，并計算出趨勢公式：Y（OD490）=A×LDH活力單位（mU）+B，可通過Excel等軟件計算出趨勢線的斜率和截距；

                  b. 檢測體系中LDH活性（mU）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490－B）/A

                  c. 樣品LDH活性（mU/mL）=檢測體系中LDH活性（mU）/檢測體積（mL）

注意事項

      1. 細胞檢測時，密度不要超過85%，細胞的狀態(tài)和密度等因素都會對細胞LDH釋放造成一定的影響，且樣品準備好后，盡量當天完成檢測，不要冷凍；

      2. 血清中含有乳酸脫氫酶，建議使用無血清或者低血清培養(yǎng)基；如必須使用10%血清，需設(shè)置無細胞對照組，以消除背景干擾；

      3. 操作時盡量溫和，避免產(chǎn)生氣泡，以免對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響；

      4. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。