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      Calcein AM是在Calcein（鈣黃綠素）的基礎(chǔ)上，引入了一個(gè)乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，AM基團(tuán)不僅掩蓋了Calcein螯合鈣的分子部分且增強(qiáng)了其疏水性，因此可以使Calcein AM輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)Calcein AM進(jìn)入細(xì)胞后，能夠被細(xì)胞內(nèi)源性酯酶剪切為Calcein。失去AM基團(tuán)后，Calcein不能輕易通過(guò)細(xì)胞膜，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)；此外螯合鈣的分子部分被暴露出來(lái)，Calcein探針和細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后，能夠發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。而死細(xì)胞缺乏酯酶，不能使Calcein AM被水解成能Calcein，故無(wú)法標(biāo)記死細(xì)胞。PI（碘化丙啶）能夠嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光，但是不能直接染色活細(xì)胞的細(xì)胞膜，只能染色細(xì)胞膜被破壞的死細(xì)胞。因此將Calcein-AM與PI聯(lián)合使用，可對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。

      本試劑盒基于上述原理，且經(jīng)過(guò)本司優(yōu)化和調(diào)試，通過(guò)Calcein-AM標(biāo)記活細(xì)胞，PI標(biāo)記死細(xì)胞來(lái)進(jìn)行雙重染色標(biāo)記，從而可以對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞水平分析。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋運(yùn)輸；-20℃避光保存，至少12個(gè)月有效。

操作步驟

      1. Calcein AM/PI檢測(cè)工作液配置：

            a) 將低溫保存的Calcein-AM試劑、PI試劑、檢測(cè)緩沖液恢復(fù)到室溫；

            b) 根據(jù)需要配置檢測(cè)工作液，配置體系可參考下表，注意不同細(xì)胞特性不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況添加或減少探針的使用濃度，大多數(shù)細(xì)胞稀釋比在1：500-2000之間；

      2. 細(xì)胞染色標(biāo)記：

            a) 根據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)安排，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行前藥物或其他刺激處理；

            b) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，需要先收集原上清，并使用胰酶消化后收集全部細(xì)胞；對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接收集全部細(xì)胞；

            c) 將收集的細(xì)胞，800-1000 rpm離心3-5 min，去除上清，使用PBS或其他緩沖液充分洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的酯酶活性；

            d) 加入上述Calcein AM/PI檢測(cè)工作液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度控制在1×10⁵~1×10⁶個(gè)/mL；

            e) 于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，避光孵育15-30 min；

      3. 細(xì)胞染色觀(guān)察：

            a) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀等儀器進(jìn)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞水平進(jìn)行觀(guān)察分析；

            b) 其中Calcein-AM標(biāo)記的活細(xì)胞為綠色熒光，EX/EM=494/517 nm；PI標(biāo)記的死細(xì)胞為紅色熒光，EX/EM=535/617 nm。

注意事項(xiàng)

      1. 由于不同細(xì)胞間性質(zhì)以及不同檢測(cè)方式不同，步驟中描述的使用探針濃度以及孵育時(shí)間范圍僅供參考，可根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。

      2. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光操作，以減緩熒光猝滅。

      3. Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，首次使用時(shí)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排適當(dāng)分裝。Calcein AM/PI檢測(cè)工作液請(qǐng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

      4. 為了您的健康和安全，操作時(shí)請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好手套。