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      3'-O-Acetyl-2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester

      3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光素,二乙酰甲酯

      BCECF AM是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH敏感的新型熒光探針，分別用490 nm和440 nm波長(zhǎng)激發(fā)BCECF所得到的發(fā)射熒光之比與pH有很好的線性關(guān)系。

      BCECF AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，BCECF-AM沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成BCECF，從而被留在細(xì)胞內(nèi)。BCECF在適當(dāng)?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。

      BCECF AM不僅被廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究，也有報(bào)道用于動(dòng)物組織、植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等的細(xì)胞內(nèi)pH水平檢測(cè)。在有細(xì)胞內(nèi)pH變化的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、藥物抵抗、細(xì)胞趨化等過(guò)程中BCECF AM被廣泛應(yīng)用。

      BCECF AM (pH熒光探針)需用無(wú)水DMSO(anhydrous DMSO)配制

產(chǎn)品特性

      7.0 的 pKa 值是理想匹配到正常范圍的細(xì)胞質(zhì)的 pH（約為 6.8-7.4）；

      熒光激發(fā)特性是 pH 依賴型，可以進(jìn)行比率測(cè)定；

      具有最大吸光度的 BCECF 堿形式激發(fā)譜非常接近 488 nm 氬激發(fā)，適合應(yīng)用于激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀。

實(shí)驗(yàn)步驟

      配制 BCECF, AM 儲(chǔ)存液

      BCECF AM 需用無(wú)水 DMSO 配制，配制成 1~10 mM 的儲(chǔ)存液。BCECF AM 儲(chǔ)存液置于 ≤–20°C 干燥條件下保存。按照推薦的儲(chǔ)存條件，該儲(chǔ)存液可穩(wěn)定保存至少 6 個(gè)月。常用的 BCECF, AM 工作液濃度為 1～10 μM，使用去離子水進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議將工作液進(jìn)行保存。

      哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色：

      低濃度的 BCECF AM 染色哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，大多數(shù)情況下可不經(jīng)細(xì)胞透化處理。當(dāng)染料分子進(jìn)入細(xì)胞之后，在非特異的酯酶水解作用下去 AM 前體，形成 pH 敏感、具有熒光信號(hào)的BCECF 探針，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生明亮的熒光信號(hào)。一般來(lái)講，BCECF 可在胞漿內(nèi)自由的游離分布并富集，并不能擴(kuò)散至胞外。

      1. 制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度約為 1×10^6 cells/ml。

      注意: 對(duì)于貼壁細(xì)胞，也請(qǐng)盡量保證細(xì)胞濃度約為 10^6 cells/mL，并使用相同的染色條件。

      2. 使用緩沖溶液（如 HBSS、PBS 緩沖液等）將 1 mM BCECF AM 儲(chǔ)存液稀釋100~500 倍。

      3. 按體積比 1:1 將稀釋的 BCECF AM 染液加入細(xì)胞懸液中，混勻。4℃或 37℃孵育15~60 分鐘。

      4. 使用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，重復(fù)一次。

      5. 使用熒光顯微鏡或帶有圖像分析系統(tǒng)的激光共聚顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

      組織樣本染色：

      組織樣本的染色處理方法與哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色類似，比如大鼠動(dòng)脈、大鼠唾液腺和胰腺、大鼠腎臟、兔胃腺體等。

      1. 處理這些組織樣本時(shí)，將樣本安置在灌注室，建議以 1~5 μM 的 BCECF,AM 工作濃度配制好灌流液，灌注時(shí)間為 5~60 分鐘。隨后用未改性的灌流液（普通灌流液）充分洗滌樣本。

      2. 對(duì)于細(xì)胞間質(zhì)的 pH 測(cè)量，可以通過(guò)直接注射 0.2~0.5 mM BCECF 酸的方法，獲得一個(gè)短暫的脈沖。BCECF 酸可以通過(guò)擴(kuò)散作用被加載到分離的細(xì)胞或組織切片中，再通過(guò)熒光成像儀成像、或用電生理記錄儀記錄。

      其它類型細(xì)胞染色：

      細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都可以通過(guò)簡(jiǎn)單的酸休克反應(yīng)（0.5 mM BCECF 酸溶于5 mM 的 HCl 溶液中，處理細(xì)菌細(xì)胞 5 分鐘）從而完成 BCECF 染色。置于冰上孵育時(shí)，染料可以很好的滯留在細(xì)胞內(nèi) ，但在乳糖的刺激下可以導(dǎo)致電位變化，繼而導(dǎo)致染料自胞內(nèi)快速流出。

      真菌：嘗試用濃度為 10 μM 的 BCECF AM 的孵育細(xì)胞，但結(jié)果顯示染料對(duì)這兩種菌的染色效果并不理想，可能是由于酵母細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解效率較低，在Neurospora crassa 真菌內(nèi)染色的結(jié)果甚至為染料不均勻分布，導(dǎo)致出現(xiàn)空泡堆積。

      植物：培養(yǎng)懸浮原生質(zhì)體（2×106 cells/ml），利用低濃度（10 nM）的 BCECF AM 可以得到染料在胞內(nèi)均勻分布的結(jié)果，而高濃度（3 μM）的 BCECF AM 在加載到玉米根毛細(xì)胞中的結(jié)果顯示染料基本富集于液泡中。

案例分析

注意事項(xiàng)

      熒光染料不可避免的存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)存放操作時(shí)注意避光，以減緩熒光的淬滅。

      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。