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      DiI、DiO、DiD 和 DiR 屬于長(zhǎng)鏈二烷基羰花青化合物，是一系列親脂性的熒光染料，可用于細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)染色，是一類環(huán)境敏感型熒光染料。當(dāng)它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強(qiáng)度很弱）結(jié)合時(shí)，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。這類染料具有很高的摩爾消光系數(shù)，極性依賴性的熒光和很短的激發(fā)壽命。

      DiD 是 DiI 的衍生物，具有明顯往紅光遷移的激發(fā)和發(fā)射光譜，這一特性使其特別適合標(biāo)記具顯著自熒光效應(yīng)的細(xì)胞或組織。DiD 可被 633nm 的氦-氖（He-Ne）激光所激發(fā)，呈紅色熒光，在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，進(jìn)入細(xì)胞后，染料在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散，最佳濃度時(shí)可以使整個(gè)細(xì)胞染色。

產(chǎn)品參數(shù)

      激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：644/663nm

      運(yùn)輸條件：常溫

      儲(chǔ)存條件：-20℃，避光

      分子式：C61H99ClN2O4

      分子量：959.92

      CAS號(hào)：127274-91-3

實(shí)驗(yàn)步驟

      制備儲(chǔ)存液

      將固體染料溶于DMF或DMSO或乙醇配制為1 mM的儲(chǔ)存液。配制好的儲(chǔ)存液，在避光-20°C的條件下至少可以保存6個(gè)月。

懸浮細(xì)胞的染色

      1 將細(xì)胞以 1 × 10^6/ml 的密度懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基中；

      2 每 1ml 細(xì)胞懸液加入 5μl 細(xì)胞染色液，混勻；

      3 37°C 孵育 1~20 分鐘。不同類型的細(xì)胞孵育條件不一樣，可參考表格 1。初始孵育時(shí)間可選擇 20 分鐘，然后再進(jìn)行優(yōu)化；

      4 將孵育后的細(xì)胞懸液 37°C，1500rpm，離心 5 分鐘；

      5 棄去上清，用 37°C 的培養(yǎng)基輕輕懸浮細(xì)胞；

      6 重復(fù)以上洗滌步驟（1.4 和 1.5）兩次；

      7 放置 10 分鐘后測(cè)定熒光信號(hào)。

懸浮細(xì)胞的染色

      1 放置干凈的載玻片在培養(yǎng)皿內(nèi)，讓細(xì)胞爬片生長(zhǎng)至合適濃度；

      2 取出爬片，用吸水紙從邊緣輕輕吸去多余的培養(yǎng)基，然后將爬片放置于濕盒內(nèi)；

      3 配制染色液：每 1ml 培養(yǎng)基加入 5μl 細(xì)胞染色液；

      4 用移液器吸取 100μl 步驟 2.3 中配制好的染色液，從邊角處加入爬片，輕輕搖動(dòng)使所有染色液覆蓋整個(gè)爬片；

      5 將爬片置于 37°C 孵育，不同類型的細(xì)胞孵育的時(shí)間不盡相同（參考表 1）；對(duì)于未在表中列出的細(xì)胞類型，建議孵育時(shí)間設(shè)為 20 分鐘，然后再進(jìn)行優(yōu)化以獲得均一的染色效果；

      6 吸去染色液，加入溫育過(guò)的培養(yǎng)基孵育 10 分鐘，重復(fù)此洗滌步驟三次。

案例分析