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      Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8（或CCK8）試劑盒，是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。其檢測原理在于，在電子耦合試劑存在的情況下，檢測試劑中的WST-8化合物被活細(xì)胞內(nèi)脫氫酶還原成具有水溶性的橙黃色甲臜化合物,該物質(zhì)在450 nm處有最大吸收峰。甲臜量與活細(xì)胞數(shù)成正比，即細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。本試劑盒中WST-8對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，可以用于外源細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測，以及藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制檢測，是MTT檢測方法的升級(jí)版。

      本試劑盒使用便捷，無需配制或稀釋，無需收集或洗滌細(xì)胞，無需對(duì)甲臜化合物進(jìn)行再次溶解，對(duì)貼壁細(xì)胞及懸浮細(xì)胞均適用。且酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測定無明顯影響。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋（wet ice）運(yùn)輸；2-8℃保存12個(gè)月有效；長期不用也可-20℃保存，24個(gè)月有效；長期保存建議避光保存。

操作步驟

1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)進(jìn)行次操作）

      A) 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

      B) 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)復(fù)孔。

      C) 接種后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD 值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間）。

2. 細(xì)胞活性檢測

      A) 在 96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在 37℃，5% CO2 的條件下）。

      B) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 OD 值的讀數(shù)）。

      C) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2小時(shí)。

      D) 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

      E) 如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 h內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

3. 細(xì)胞增殖-毒性檢測

      A) 在 96 孔板中配置 100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)（在 37 ℃，5% CO₂ 的條件下）。

      B) 向培養(yǎng)板加入 10 μL 不同濃度的待測物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24 或 48 小時(shí)）。

      C) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 OD 值的讀數(shù)）。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。

      D) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2小時(shí)。

      E) 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

      F) 如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1% SDS (W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

4. 活力計(jì)算：

      細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

      A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

      A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

      A（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

      細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項(xiàng)

      1. 本試劑盒檢測原理是依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，樣品中如有較多還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測，需設(shè)法去除。

      2. 建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

      3. 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間。

      4. 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為 1 ,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個(gè)/孔 ( 100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

      5. 如果沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 檢測靈敏度最高。

      6. 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測造成影響。

      7. 加檢測試劑時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)干擾檢測結(jié)果。

      8. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。