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      本試劑盒采用改良的SDS-堿裂解法，優(yōu)化的裂解液可以使得離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA，結(jié)合先進(jìn)的硅膠膜吸附技術(shù)，可達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。適用于從1-5 mL的細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至25 μg高純度的質(zhì)粒DNA。本試劑盒可去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。質(zhì)粒提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類(lèi)和培養(yǎng)條件，細(xì)胞的裂解，質(zhì)?？截悢?shù)，質(zhì)粒的穩(wěn)定性，抗生素等因素有關(guān)。溶液包含指示劑，通過(guò)其顏色的變化，指示重懸、裂解、中和是否完全，從而保證質(zhì)粒提取的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)可視化的操作流程。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于酶切、PCR、測(cè)序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫(kù)篩選、體外翻譯等。

      RNase A冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其余試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存；有效期12個(gè)月。

1. 使用前請(qǐng)先檢查Buffer BL、Buffer S2、S3、PD是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱數(shù)分鐘，即可恢復(fù)澄清。

2. Buffer S1在使用前先加入全部的RNase A并混勻，置于2-8℃保存。

3. Buffer PW使用前請(qǐng)先檢查是否加入指定量的無(wú)水乙醇。

4. 柱平衡步驟中Buffer BL的加入能夠改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和穩(wěn)定性，消除高溫、潮濕或其他不良環(huán)境因素對(duì)吸附柱造成的影響。

1. （可選步驟）柱平衡：將吸附柱（Bind DNA Mini Columns）置入收集管（Collection Tubes）中，向吸附柱中加入500 μL溶液Buffer BL，10,000 g離心1 min，去除收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）；

2. 細(xì)菌收集：取1-5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液加入離心管中，10,000 g離心1 min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）；

3. 重懸：向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μL溶液Buffer S1（使用前請(qǐng)先檢查瓶中是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底重懸菌體沉淀，混勻后的溶液為渾濁的紅色，室溫靜置5 min（注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低）；

4. 裂解：向離心管中加入250 μL溶液Buffer S2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解（注意：溫和混合，不要?jiǎng)×艺鹗?；此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變清亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。添加Buffer S2徹底混勻后，溶液顏色為澄清的紫色；如紫色中混雜有渾濁的紅色，則說(shuō)明裂解不充分，繼續(xù)混勻直至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓淖仙?；裂解建議室溫不超過(guò)5 min）；

5. 中和：向離心管中加入350 μL溶液Buffer S3，立即快速地上下顛倒混勻6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)絮狀沉淀，13,000 g離心10-15 min（注意：加入溶液Buffer S3后應(yīng)立即混合，上清中含有少量微小白色沉淀對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響；如上清中存在大量微小白色沉淀，可再次離心后取上清；添加Buffer S3徹底混勻后，溶液為澄清的黃色，如在黃色中混有紫色，則說(shuō)明復(fù)性不充分，繼續(xù)混勻至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓狞S色）；將收集的上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，注意盡量不要吸取沉淀，10,000 g離心1 min，棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

6. 向吸附柱中加入500 μL溶液Buffer PD，10,000 g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

7. 向吸附柱中加入700 μL溶液Buffer PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），10,000 g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中（注意：如果回收的DNA是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議Buffer PW加入后靜置2-5 min再離心）；

8. 重復(fù)操作步驟7；

9. 將吸附柱放入收集管中，10,000 g離心2 min，盡量除去殘留的液體；將吸附柱置于室溫放置5 min，徹底晾干（注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶切、PCR等實(shí)驗(yàn)）；

10. 將吸附柱放入一個(gè)干凈離心管中，向吸附中的膜中間位置懸空滴加50~100μL Elution Buffer或ddH2O（60-65℃預(yù)熱Elution Buffer或ddH2O后再使用效果更好），室溫放置2 min，10,000 g離心2 min，收集DNA溶液（注意：洗脫液的體積不應(yīng)少于50 μL，體積過(guò)少會(huì)影響回收的效率。為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2 min，10,000 g離心2 min，將DNA溶液收集到離心管中。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有較大影響。若后續(xù)做測(cè)序，建議使用ddH₂O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解）。

1. 提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10 mL過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加Buffer S1、S2、S3的用量，Elution Buffer應(yīng)在60-65℃水浴預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，以提取效率。其它步驟相同。

2. 各溶液使用后請(qǐng)及時(shí)將蓋子擰緊，防止溶劑揮發(fā)。

3. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套。