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      本試劑盒是用于從動物組織和細(xì)胞樣本中經(jīng)柱式法提取純化RNA的廣譜型試劑盒。試劑盒采用了特別的裂解緩沖系統(tǒng)，無需苯酚、氯仿等有機(jī)試劑抽提，并分別經(jīng)過gDNA Eraser Spin Column（去除基因組DNA）以及RNA Spin Column（結(jié)合RNA），可從5-20 mg的動物組織、10⁶-10⁷新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞中快速提取高純度的RNA，整個提取過程僅需30 min即可完成。獲得的RNA可以直接用于Northern雜交、斑點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNA分解酶的保護(hù)分析、RT-PCR、Real Time RT-PCR和構(gòu)建cDNA文庫等各種分子生物學(xué)實驗。

儲存與運(yùn)輸

      Proteinase K，DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃儲存；其他試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲存；有效期12個月。

使用前準(zhǔn)備

1. Buffer RL1如有沉淀現(xiàn)象，請于37℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

2. 操作前請向Buffer RL1加入DTT Solution，至終濃度為4%，即1 mL Buffer RL1加入40 μL DTT Solution。此裂解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，加入DTT Solution的Buffer RL1可在4℃放置一個月。

3. 使用前請向Buffer RW1和Buffer RW2中加入指定量（見瓶身）的無水乙醇。

4. 按照提取樣本量提前配制60%異丙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

5. 使用研磨儀研磨組織時，將研磨儀提前預(yù)冷。

操作步驟

1. 樣本裂解：

a. 動物組織：取新鮮、超低溫凍存或組織RNA穩(wěn)定保存液（推薦ABC3037）保存的動物組織5-20 mg，置于裝有2-3顆3 mm研磨珠（推薦ABC0221-150G）的1.5 mL RNase-free離心管或?qū)Ｓ醚心ス苤校⒓醇尤?00 μL Buffer RL1（使用前請確認(rèn)已加入DTT Solution），使用組織研磨儀（推薦ABC901001）在低溫條件下將組織徹底研磨至勻漿狀（如果組織沒有被徹底勻漿，將會影響RNA的得率和質(zhì)量），再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

b. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入1.5 mL RNase-free離心管中，1,000 rpm離心5 min，收集懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞（10⁶-10⁷），輕輕吸棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μL Buffer RL1（使用前請確認(rèn)已加入DTT Solution），用移液器反復(fù)吹打均勻至無明顯沉淀，再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育10-15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

c. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：倒出培養(yǎng)液，用1×PBS（pH 7.4）清洗一次。向培養(yǎng)細(xì)胞中加入適量的Buffer RL1（使用前請確認(rèn)已加入DTT Solution）,水平放置培養(yǎng)皿，使裂解液均勻的分布在細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，然后使用移液器輕輕吹打，使細(xì)胞完全脫落，分別轉(zhuǎn)移500 μL含有細(xì)胞的裂解液至1.5 mL RNase-free離心管中，再加入10 μL Proteinase K，混勻后56℃孵育15 min，12,000 rpm，4℃離心5 min。

2. 將第一步的動物組織或細(xì)胞裂解液上清轉(zhuǎn)移至gDNA Eraser Spin Column中（避免吸取沉淀），12,000 rpm，室溫離心1 min；

3. 棄掉gDNA Eraser Spin Column，保留Collection Tube中的濾液；

4. 向上述步驟的濾液中加入等體積的60%異丙醇（此時可能會出現(xiàn)沉淀），用移液器吹打混勻；

5. 立即將混合液（含沉淀）全部轉(zhuǎn)移至RNA Spin Column中，每次加入量不超過600 μL，如果超過600 μL可分批加入；

6. 12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將RNA Spin Column重新放回Collection Tube中；

7. 向RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RW1，12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液；

8. 向RNA Spin Column中加入600 μL Buffer RW2（請沿RNA Spin Column管壁加入Buffer RW2，有助于沖洗管壁上殘留的鹽分），12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液；

9. DNase消化（可選擇）：本試劑盒中的試劑和gDNA Eraser Spin Column可以有效地去除大部分的基因組DNA，提取的RNA很少含基因組DNA。對于部分基因組DNA含量較高的組織（如肝臟、腎、脾等）或后續(xù)實驗對RNA純度要求比較嚴(yán)格，可以選擇性地在RNA Spin Column吸附柱膜上進(jìn)行DNase消化；

      a) DNase反應(yīng)液的配制：取5 μL 10×DNase Buffer，5 μL DNase，40 μL Nuclease-free Water于一新的1.5 mL RNase-free離心管中混勻；

      b) 向RNA Spin Column中央加入50 μL DNase反應(yīng)液，室溫靜置15 min；

      c) 向RNA Spin Column吸附柱中加入500 μL Buffer RW2，12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將吸附柱放回收集管中；

10. 重復(fù)操作步驟8；

11. 將RNA Spin Column放入Collection Tube中，12,000 rpm，室溫離心2 min，除去殘留的液體；

12. 將RNA Spin Column置于一新的1.5 mL RNase-free離心管中，室溫放置3-5 min，使RNA Spin Column殘留的乙醇完全揮發(fā)；

13. 向RNA Spin Column的膜中央加入50-100 μL Nuclease-free Water，室溫靜置5 min，12,000 rpm，室溫離心2 min洗脫RNA。若要得到更高濃度的RNA，也可以將第一次的洗脫液重新加回至RNA Spin Column中，室溫靜置5 min，12,000 rpm，室溫離心2 min，再次收集RNA。

注意事項

1. 操作之前，請務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 使用新鮮的組織或培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行提取。若組織或細(xì)胞需要長期保存，建議使用RNAsolid組織RNA穩(wěn)定保存液（推薦ABC3037），可迅速抑制RNase并穩(wěn)定保存樣本中的RNA。

3. 實驗時穿實驗服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用無RNase的槍頭、離心管避免交叉污染。

4. 應(yīng)使用RNA提取專用操作實驗臺與電泳設(shè)備。

附表：

本試劑盒對不同組織以及細(xì)胞的總RNA提取量見下表，組織或細(xì)胞的總RNA提取量與其新鮮程度或生長狀態(tài)有關(guān)，下表僅供參考。