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      本試劑盒適用于新鮮血液樣本中總RNA的提取。利用新型的離心吸附柱搭配獨(dú)特的裂解試劑可以高效回收高純度的血液總RNA，不需要苯酚、氯仿等試劑，僅需1 h，就能夠快速地從小于1.5 mL的全血中提取總RNA，并有效地去除雜質(zhì)蛋白。提取的RNA可直接用于RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其他試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存；有效期12個(gè)月。

使用前準(zhǔn)備

1. Buffer RL如有沉淀，請于37℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

2. 操作前請向Buffer RL加入DTT Solution，至終濃度為4%，即1 mL Buffer RL加入40 μL DTT Solution。此裂解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，加入DTT Solution的Buffer RL可在4℃放置一個(gè)月。

3. 使用前請向Buffer RW1加入18 mL無水乙醇，向Buffer RW2中加入72 mL的無水乙醇。

4. 使用前請用DEPC水配制70%的乙醇。

操作步驟

1. 紅細(xì)胞裂解液的稀釋：使用Nuclease-free Water將10×Red cell Lysis Buffer稀釋至1×備用（當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要取140 μL 10×Red cell Lysis Buffer進(jìn)行稀釋）；

2. 取1體積的血液樣本加入5體積的1×Red cell Lysis Buffer，混勻。如：當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要加入1 mL 1×Red cell Lysis Buffer；

3. 置于冰上孵育15 min，期間上下顛倒混勻2-3次，當(dāng)溶液變?yōu)榘胪该鲿r(shí)，說明紅細(xì)胞裂解完全。根據(jù)血液樣本裂解的程度不同，可以將孵育時(shí)間延長至20 min；

4. 3,000 rpm，4℃離心10 min，將上清完全去除，請勿將白細(xì)胞沉淀吸出；

5. 向白細(xì)胞沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Red cell Lysis Buffer（如：當(dāng)血液樣本量為200 μL時(shí)，則需要加入400 μL 1×Red cell Lysis Buffer），懸浮白細(xì)胞沉淀；

6. 3,000 rpm，4℃離心10 min，將上清完全去除，請勿將白細(xì)胞沉淀吸出；

7. 根據(jù)處理血液樣本體積加入Buffer RL懸浮白細(xì)胞沉淀（使用前請確認(rèn)已加入DTT Solution）。當(dāng)血液樣本量小于0.5 mL時(shí)，加入400 μL Buffer RL；當(dāng)血液樣本量為0.5-1.5 mL時(shí)，加入600 μL Buffer RL；

8. 將上述溶液轉(zhuǎn)移至gDNA Eraser Spin Column中，12,000 rpm，室溫離心2 min，棄掉gDNA Eraser Spin Column，收集濾液；

9. 向?yàn)V液中加入等體積70%乙醇（此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀），使用移液器吹打混勻；

10. 將上述混合液（含沉淀）全部轉(zhuǎn)移至RNA Spin Column，每次加入量不超過600 μL，如果超過600 μL可分批加入；

11. 12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將RNA Spin Column放回Collection Tube中；

12. 向RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RW1，12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將RNA Spin Column放回Collection Tube中；

13. 向RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RW2（請沿RNA Spin Column管壁加入Buffer RW2，有助于沖洗管壁上殘留的鹽分），12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將RNA Spin Column放回Collection Tube中；

14. DNase消化（可選擇）：

      a） DNase反應(yīng)液配制：取5 μL 10×DNase Buffer，5 μL DNase，40 μL Nuclease-free Water于Nuclease-free離心管中混勻；

      b） 向RNA Spin Column中央加入50 μL DNase反應(yīng)液，室溫靜置15 min；

      c） 向RNA Spin Column中加入600 μL Buffer RW2，12,000 rpm，室溫離心30 s，棄掉廢液，將RNA Spin Column放回Collection Tube中；

15. 重復(fù)步驟13；

16. 12,000 rpm，室溫離心2 min，除去殘留的液體；

17. 將RNA Spin Column置于一新的1.5 mL Nuclease-free離心管中，室溫放置3-5 min，使RNA Spin Column殘留的乙醇完全揮發(fā)；

18. 向RNA Spin Column的膜中央加入30-50 μL Nuclease-free Water，室溫放置5 min，12,000 rpm，室溫離心2 min洗脫RNA。若要得到更高濃度RNA，可將第一次的洗脫液重新加回RNA Spin Column中，室溫靜置5 min，12,000 rpm，室溫離心2 min，再次收集RNA。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 本試劑盒的最大樣品處理量為1.5 mL（白細(xì)胞數(shù)量1×107），如果血液中白細(xì)胞含量較高，可以按比例減少血液用量。

3. 本試劑盒適用于常規(guī)抗凝劑（包括肝素鈉、EDTA、枸櫞酸鈉等）保存的血液RNA提取。

4. 實(shí)驗(yàn)時(shí)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用Nuclease-free的槍頭、離心管。

5. 應(yīng)使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)與電泳設(shè)備。