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      本試劑盒適用于福爾馬林固定、石蠟包埋組織（FFPE）的RNA提取，采用特殊的脫蠟試劑，不含二甲苯等有機(jī)溶劑，安全無毒，可有效地去除石蠟并釋放出組織樣本。本試劑盒利用特殊的裂解緩沖液能高效地裂解組織，結(jié)合離心柱法能快速有效地提取石蠟包埋組織的RNA，提取過程可在1 h內(nèi)完成，RNA產(chǎn)量大，純度和完整程度高，適用于RT-PCR和Real-Time PCR等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      DNase和Proteinase K冰袋（wet ice）運(yùn)輸，-20℃保存；其它試劑室溫運(yùn)輸，室溫儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。

使用前須知（請(qǐng)仔細(xì)閱讀）

1. 提前準(zhǔn)備80℃和55℃的水浴或加熱塊。

2. 如果Buffer CRL和Buffer FRB出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

3. DNase工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 使用前請(qǐng)向Buffer RW2中加入64 mL的無水乙醇，混合均勻后使用。

操作步驟

1. 樣本處理

      I. 石蠟切片：取石蠟切片（5-10 μm厚，1×1 cm2大?。?-8張，若樣本暴露于空氣中，則表面的2-3張丟棄不用。

      II. 石蠟塊：用滅菌手術(shù)刀刮取約30 mg的組織樣本，盡量去除多余的石蠟并切碎樣本。

      III. 福爾馬林浸泡的樣本組織：用濾紙吸干樣本表面的液體，取約30 mg樣本，切碎并置于1.5 mL離心管中，加入500 μL 1×PBS緩沖液（pH 7.4），渦旋振蕩10 s后12,000 rpm室溫離心1 min，棄上清，重復(fù)3次。

2. 將樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入500 μL Buffer DP，80℃孵育3 min，趁熱渦旋振蕩10 s；

3. 向離心管中加入200 μL Buffer CRL，渦旋振蕩混勻，12,000 rpm室溫離心1 min，溶液形成上下兩層（上層為油相，下層為水相）；

4. 于下層水相中加入20 μL Proteinase K，使用移液器輕輕吹打混勻（盡量不要破壞分層），55℃孵育15 min；

5. 隨后將離心管轉(zhuǎn)移至80℃孵育15 min（若只有一個(gè)加熱模塊，此步請(qǐng)將含樣本的離心管先置于室溫，當(dāng)加熱模塊溫度達(dá)到80℃后再將離心管放入加熱模塊中），上下顛倒混勻；

6. 12,000 rpm室溫離心5 min，溶液形成上下兩層（上層為油相，下層為水相）；

7. 取下層水相溶液至一新的Nuclease-free 1.5 mL離心管中（不要取到上層油相溶液和其他雜質(zhì)），加入等水相體積的Buffer FRB和3倍水相體積的無水乙醇（可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），使用移液器吹打混勻；

8. 將混合液全部轉(zhuǎn)移至RNA Spin Column中，12,000 rpm室溫離心2 min，棄濾液；

9. 配制DNase工作液：取35 μL Nuclease-free Water，5 μL 10×DNase Reaction Buffer和10 μL DNase于一新的Nuclease-free離心管中，使用移液器輕輕吹打混勻；

10. 將DNase工作液懸空滴加到RNA Spin Column的膜中央，室溫靜置15 min；

11. 向RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RW1，12,000 rpm室溫離心1 min，棄濾液；

12. 向RNA Spin Column中加入600 μL Buffer RW2（請(qǐng)沿管壁加入Buffer RW2，有助于沖洗管壁上殘留的鹽分），12,000 rpm室溫離心1 min，棄濾液；

13. 重復(fù)步驟12；

14. 將RNA Spin Column置于收集管上，12,000 rpm室溫離心2 min，取出RNA Spin Column置于一新的Nuclease-free1.5 mL離心管上；

15. 將RNA Spin Column開蓋室溫放置3-5 min，盡量使殘留乙醇揮發(fā)完全；

16. 向RNA Spin Column的膜中央懸空加入50-100 μL Nuclease-free Water，室溫靜置5 min，12000 rpm離心2 min，收集RNA溶液。若要得到更高濃度的RNA，也可以將第一次的洗脫液重新加回至RNA Spin Column中，室溫靜置5 min，12000 rpm離心2 min，再次洗脫RNA。

注意事項(xiàng)

1. 操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀本產(chǎn)品說明書。

2. 本試劑盒提取RNA的得率和完整性依賴于樣本種類，固定時(shí)間、固定條件以及樣本儲(chǔ)存時(shí)間等。固定時(shí)間最好在8-24 h以內(nèi)，如果樣本固定時(shí)間超過24小時(shí)或者存放時(shí)間超過1年，則可能會(huì)導(dǎo)致RNA大量降解。

3. 樣本包埋前需完全脫水，以防止殘留的福爾馬林對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。

4. 包埋組織取樣時(shí)應(yīng)盡量去除多余的石蠟并切碎樣本，且取樣量不要超過30 mg，否則易造成裂解不充分的情況，影響核酸得率。

5. FFPE樣本中純化的核酸不建議用于需要全長(zhǎng)RNA的下游應(yīng)用。

6. 實(shí)驗(yàn)時(shí)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免講話，使用Nuclease-free的槍頭和離心管以避免交叉污染。

7. 應(yīng)使用RNA提取專用操作實(shí)驗(yàn)臺(tái)與電泳設(shè)備。