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      本產(chǎn)品BrdU檢測(cè)試劑盒，用于細(xì)胞和組織切片的細(xì)胞增殖檢測(cè)。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，本試劑盒的原理在于，BrdU可以通過競(jìng)爭(zhēng)替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測(cè)出含有BrdU的細(xì)胞，結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記，可判斷出增殖細(xì)胞的種類、增殖速度等，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入組織細(xì)胞，摻入DNA定位準(zhǔn)確，可有效反應(yīng)S期細(xì)胞新合成DNA的水平，而且受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標(biāo)記不會(huì)丟失。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

      冰袋（wet ice）運(yùn)輸；破膜液、封閉液（3% BSA）、1 M HCl可4℃保存，4%多聚甲醛可常溫保存，anti-BrdU (mouse mAb)需-20℃保存，有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

      1. 自備PBS緩沖液（推薦ABC4220）、二抗、梯度乙醇、封片劑等；

      2. 自備細(xì)胞核染色液，推薦ABC1022蘇木素染液或ABC1030 DAPI染液（即用型）；

      3. 配制anti-BrdU一抗工作液：將anti-BrdU(mouse mAb)用封閉液（3% BSA）稀釋100倍，配制成anti-BrdU一抗工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存；

      4. 二抗工作液：根據(jù)檢測(cè)需要自備HRP標(biāo)記（后續(xù)經(jīng)白光檢測(cè)，配套DAB顯色試劑盒，推薦ABC1230）或熒光標(biāo)記（后續(xù)熒光檢測(cè)）的抗小鼠二抗，并用PBS稀釋配制成二抗工作液。

操作步驟

細(xì)胞樣品：

      1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：提前準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，確保細(xì)胞狀態(tài)正常，貼壁良好；

      2. BrdU孵育：細(xì)胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，BrdU濃度及細(xì)胞孵育時(shí)間依據(jù)細(xì)胞種類不同，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳條件。注意事項(xiàng)中已測(cè)試細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件可供參考；

      3. 細(xì)胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5 min。向孔板內(nèi)加入1 mL 4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞，室溫固定20-30 min。PBS洗3次，每次5 min；

      4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細(xì)胞處理8-10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      5. 細(xì)胞核染色（可選）：

      若后續(xù)白光檢測(cè)，則用蘇木素染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5 min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5 min；

      若后續(xù)熒光檢測(cè)，則用DAPI染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5 min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5 min；

      6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1 M HCl覆蓋細(xì)胞，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30 min。吸棄封閉液，不要清洗；

      10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細(xì)胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

      11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1 h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；

      12. 封片及鏡檢：

      若是HRP標(biāo)記的二抗，則用DAB顯色試劑（推薦ABC1230）對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行顯色，脫水，透明，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在潔凈的載玻片上封片，顯微鏡觀察；

      若是熒光標(biāo)記的二抗，在潔凈載玻片上滴加抗熒光淬滅封片劑（推薦ABC1419），用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察；

組織切片樣品：

      1. 動(dòng)物準(zhǔn)備：需提前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并進(jìn)行體內(nèi)BrdU標(biāo)記，可參考ABC310020-100mg。體內(nèi)標(biāo)記后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行取材、固定及制備石蠟切片；

      2. 組織石蠟切片脫蠟復(fù)水；

      3. 修復(fù)：組畫筆畫圈圈住組織，將切片浸沒在抗原修復(fù)液中，微波加熱修復(fù)，參考修復(fù)條件：額定輸入功率：1180W；微波輸出功率：700W，使用1×Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH 8.0，即用型）（貨號(hào)ABC1225)， 中火 8min ?；?8min 轉(zhuǎn)中低火 7min。微波修復(fù)的目的是讓切片在抗原修復(fù)液保持沸騰15分鐘，由于不同廠家型號(hào)的微波爐功率不一樣，達(dá)到沸騰的時(shí)間也不一樣，具體的修復(fù)條件可以根據(jù)微波爐功率的不同進(jìn)行優(yōu)化。自然冷卻；

      4. 細(xì)胞核染色（可選）：

      若后續(xù)白光檢測(cè)，則用蘇木素染細(xì)胞核：切片入蘇木素染液室溫染色5 min，PBS洗3次，每次5 min；

      若后續(xù)熒光檢測(cè)，則用DAPI染細(xì)胞核：向組織上滴加DAPI染液室溫染色5 min，傾去DAPI染液，切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；

      5. 再固定：向組織上滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆蓋組織，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆蓋組織室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      8. 內(nèi)源性過氧化物酶淬滅（可選）：向切片上滴加3% H2O2室溫孵育25-30min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。隨后切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；

      9. 封閉：向切片上滴加封閉液（3% BSA）覆蓋組織，室溫孵育30 min。去除封閉液，不要清洗；

      10. Anti-BrdU抗體孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋組織，4℃孵育過夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

      11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆蓋組織，室溫孵育1 h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；

      12. 封片及鏡檢：

      若是HRP標(biāo)記的二抗，則用DAB顯色試劑（推薦ABC1230）對(duì)組織切片進(jìn)行顯色，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察；

      若是熒光標(biāo)記的二抗，則滴加抗熒光淬滅封片劑（推薦ABC1419）封片后熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果觀察

      如果用HRP標(biāo)記的二抗檢測(cè)，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，增殖細(xì)胞呈棕色。如果是熒光標(biāo)記的二抗，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細(xì)胞為對(duì)應(yīng)二抗的熒光。

注意事項(xiàng)

      1. 對(duì)于細(xì)胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時(shí)間與細(xì)胞種類有關(guān)。一般來說，處理腫瘤細(xì)胞所需濃度和時(shí)間都較低，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞等增殖較慢的細(xì)胞需要提高濃度并延長(zhǎng)作用時(shí)間，建議濃度范圍為20-100 μM，作用時(shí)間為40 min-4 h，可根據(jù)具體細(xì)胞的種類進(jìn)行摸索調(diào)整。

      下表為測(cè)試的常用細(xì)胞處理濃度及時(shí)間，僅供參考。

      2. 為保證最佳實(shí)驗(yàn)效果，推薦使用本公司生產(chǎn)的其他配套試劑：蘇木素染液(ABC1022)；DAPI染液(ABC1030)；DAB顯色試劑盒(ABC1230），抗熒光淬滅封片劑(ABC1419)；

      3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。