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      Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8（或CCK8）試劑盒，是一種廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。其檢測原理在于，在電子耦合試劑存在的情況下，檢測試劑中的WST-8化合物被活細胞內脫氫酶還原成具有水溶性的橙黃色甲臜化合物,該物質在450 nm處有最大吸收峰。甲臜量與活細胞數(shù)成正比，即細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。本試劑盒中WST-8對細胞無明顯毒性，可以用于外源細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，以及藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測，是MTT檢測方法的升級版。

      本試劑盒使用便捷，無需配制或稀釋，無需收集或洗滌細胞，無需對甲臜化合物進行再次溶解，對貼壁細胞及懸浮細胞均適用。且酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。

儲存與運輸

      冰袋（wet ice）運輸；2-8℃保存12個月有效；長期不用也可-20℃保存，24個月有效；長期保存建議避光保存。

操作步驟

1. 制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量時進行次操作）

      A) 先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。

      B) 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細胞濃度梯度，每組 3-6 個復孔。

      C) 接種后培養(yǎng)至細胞貼壁，然后加 CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X軸），OD 值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間）。

2. 細胞活性檢測

      A) 在 96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（在 37℃，5% CO2 的條件下）。

      B) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）。

      C) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育 2小時。

      D) 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。

      E) 如果暫時不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 h內吸光度不會發(fā)生變化。

3. 細胞增殖-毒性檢測

      A) 在 96 孔板中配置 100 μL 的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 24 小時（在 37 ℃，5% CO₂ 的條件下）。

      B) 向培養(yǎng)板加入 10 μL 不同濃度的待測物質。在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12、24 或 48 小時）。

      C) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）。如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。

      D) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育 2小時。

      E) 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。

      F) 如果暫時不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1% SDS (W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時內吸光度不會發(fā)生變化。

4. 活力計算：

      細胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

      A（加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

      A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度

      A（0 加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

      細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項

      1. 本試劑盒檢測原理是依賴于脫氫酶催化的反應，樣品中如有較多還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，需設法去除。

      2. 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間。

      3. 白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。

      4. 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為 1 ,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 ( 100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

      5. 如果沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 檢測靈敏度最高。

      6. 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

      7. 加檢測試劑時避免產生氣泡，否則會干擾檢測結果。

      8. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。